Biologie-Kurs:

Bakterien-Genetik

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© Hans-Dieter Mallig (hdm)

Bakterien und Phagen

Hauptobjekt der Bakteriengenetik ist das Bakterium Echerichia coli.

Schemazeichnung von E.coli
E. Coli ist ein einzelliger Organismus von ca. 1/1000 mm Länge ohne abgegrenzten Zellkern (PROKARYONT). Das Bakteriengenom ist ein 1 mm langer ringförmig geschlossener DNS-Faden. Es fehlen die für EUKARYONTEN typischen Zellorganellen mit doppelter Membran wie Zellkern, Mitochondrien oder Plastiden (bei pflanzlichen Zellen).

Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien befallen

Phagen bestehen nur aus Nukleinsäure (DNS oder RNS) und Protein. Sie haben keinen eigenen Stoffwechsel und werden nur in lebenden Zellen vermehrt, die sie dabei zerstören. Der Phage T2 besitzt einen sechseckigen Kopf aus Protein, der DNS enthält, einen Schanzstift in einer Scheide , beides Protein, und eine Endplatte mit Stachel und Schwanzfäden.
verändert nach:Freeman

Wie vermehren sich Viren?

Viren befallen Zellen, vermehren sich in ihnen und zerstören sie. Das Beispiel handelt von Bakteriophagen, das sind Viren, die Bakterein befallen

 LYTISCHER VERMEHRUNGSZYKLUS von T2-Phagen in einem Escherichia-Coli- Bakterium 


Animation zur Adsorption und Injektion © hdm
  • 1) Adsorption: Mit Strukturen der Endplatte und des Schwanzes rastet der Phage auf einem der Rezeptoren in der Bakterienzellwand ein, die für ihn spezifisch sind. 
  • 2) Injektion: Der Schwanzschaft kontrahiert, der Schwanzstift durchdringt die Zellwand, die Phagen-DNS gelangt ins Innere der Bakterienzelle. 
  • 3) Enzymsynthese: Die Phagen-DNS steuert die Synthese phagenspezifischer Enzyme, die zu ihrer eigenen Replikation und zum Abbau der Bakterien-DNS dienen. 
  • 4) DNS-Replikation: Die Phagen-DNS schließt sich zum Ring und wird in vielen Replikationszyklen aus Nukleotiden des Bakteriums vielfach vermehrt. 
  • 5) Proteinsynthese: Durch eine Reihe von Genen in der Phagen-DNS werden die Proteine für Phagenköpfe, -schwänze und -schwanzfäden auf drei "Fließbändern" (Genwirkketten) mittels des Proteinsyntheseapparates der Bakterienzelle hergestellt. 
  • 6) Zusammenbau: Je ein Phagen-DNS-Molekül schlüpft in die Kopfhülle. Die Bauteile werden zu kompletten Phagen zusammengesetzt. 
  • 7) Lyse: Das Bakterium hat auf Anweisung der Phagen-DNS große Mengen des Enzyms Lysozym hergestellt, das die Zellwand auflöst. 50 bis 100 neue Phagen treten aus.

  • Arbeitstechniken mit Bakterien

    Nachweis und Kultivierung von Bakterien

    Bakterien, mit einer Zellgröße von ca. 1/1000 mm sind zu klein, um sie mit dem menschlichen Auge zu erkennen (Auflösungsvermögen). Läßt man sie sich jedoch auf fester Unterlage vermehren, so nimmt die Größe der entstehenden Bakterienkolonie bald eine Dimension an, die auch mit bloßem Auge zu erkennen ist.

    Hebt man für kurze Zeit den Deckel einer Petrischale mit sterilem Nährboden, so gelangen einzelne Bakterien auf den Nährboden. Bebrütet man diese Platten 1 bis zwei Tage bei ca. 25 °C, so vermehren sich die einzelnen Bakterien zu sichtbaren Bakterienkolonien und man kann so viele Kolonien zählen, wie einzelne Bakterien (mit genügend großem Abstand) auf den Nährboden gelangt sind.
    Schrägbild

    Aufsicht

    Schnitt


    Kurz nach dem Öffnen

    1 bis 2 Tage später

    nach 1 Woche 

    nach 2 Wochen 
    Ein bis zwei Tage nach dem Beimpfen kann man kleine, jedoch zählbare Kolonien erkennen. Einige Tage später sind einige der nahe beieinander liegenden Kolonien verwachsen, so daß man nicht mehr die Anzahl der ursprünglichen Bakterien bestimmen kann. Nach etwa zwei Wochen ist die ganze Platte von einer einheitlichen Bakterienschicht, einem Bakterienrasen überwachsen. Einzelne Kolonien sind nicht mehr zu erkennen. (Für die Abbildung wurden Bakterien gwählt, die rote Kolonien bilden.)
     
     
    Man kann Bakterien auch in einem Reagenzglas oder Becherglas in einer Nährbrühe vermehren und kultivieren. Hierzu benützt man z.B. eine gefilterte Fleischboullion. Die ursprünglich klare Flüssigkeit wird nach dem Beimpfen über Nacht (beim Bebrüten bei ca. 25°C) durch die Vermehrung der Bakterien trüb. Gibt man jetzt mit einer Pipette z.B. 1 ml oder besser 0,1 ml auf einen der oben beschriebenen Närböden und bebrütet ihn, bekommt man ebenfalls einen Bakterienrasen und kann keine einzelnen Kolonien auszählen.
     
     

    Bakterien-Kolonie-Zähltest

    Um Bakterienkolonien zählen zu können, muß man also die Zahl der Bakterien im Reagenzglas deutlich herunter verdünnen. In 1 ml einer Übernachtkultur können sich z.B. 1010 Bakterien befinden (Bakterien-Titer = Anzahl der Bakterien pro ml). Vernünftig auszählen kann man so etwa bis um 100, also 102 Kolonien. Wir müßten demnach um einen Faktor 10-8 herunter verdünnen. Einen Faktor 10-1 oder 1 : 10 schaffen wir z.B. indem wir 1 ml Bakteriensuspension zu 9 ml frischer Nährboullion geben.

    Wie schaffen wir 10-2, also 1 : 100?

    Einen Verdünnungsfaktor von 10-8 kann man ökonomisch nicht mehr in einem Schritt erreichen. Deshalb führt man mehrere Verdünnungsschritte hintereinander durch.

    Welche Schritte könnte man durchführen, um den Faktor 10-8 zu erreichen?

     Beispiel für eine Verdünnungsreihe:
    Um welchen Faktor wurde in der Abbildung bis zu dem Reagenzglas verdünnt, das zu den ca. 30 gewachsenen Kolonien pro Platte gehört?
    Wie viele Bakterein befanden sich ursprünglich in 1 ml der Übernachtkultur, wenn man 1 ml zum Ausplattieren benützt hat?<
    Warum befinden sich auf den Platten ganz rechts durchschnittlich nur 3 Kolonien?
    Du hast eine Bakterienkultur 2x 1: 10 und 2x 1 : 100 verdünnt und dann jeweils 1ml dieser letzten Lösung ausplattiert. Auf den Platten hast du durchschnittlich 125 Kolonien gezählt. Wie viele Bakterien befanden sich in 1 ml deiner ursprünglichen Bakterienkultur?

    Bakterien-Wachstumskurve

    Bakterien können sich unter optimalen Bedingungen sehr schnell vermehren. So kann sich das Darmbakterium E. coli z.B. alle zwanzig Minuten teilen und damit seine Anzahl verdoppeln.
    Die abgebildete Wachstumskurve zeigt die verschiedenen Phasen des Bakterienwachstums. Bringt man Bakterien aus einer Übernachtkultur in eine frische Nährlösung, so befinden sich die Bakterien zunächst in der lag-Phase, sie gewöhnen sich an das frische Medium, erholen sich von den schlechten Umweltbedingungen der vorherigen stationären Phase und vermehren sich erst nicht. Sobald sie sich genügend erholt haben, teilen sie sich alle zwanzig Minuten, wir sind in der log-Phase, wir haben exponentielles Wachstum.

    E.coli Vermehrung in 2 Stunden 20 Minuten

    Bakterien-Vermehrungskurve

    Durch die Zunahme der Bakterienzahl ist für das einzelne Bakterium die Nahrung nicht mehr so leicht zugänglich, Stoffwechselprodukte in der Brühe beeinträchtigen die Lebensbedingungen, die Teilungsrate geht zurück und hält sich mit der Zahl der verendenden Bakterien die Waage. Wir sind in der Stationären Phase.
    Durch die weitere Stoffwechselaktivität verschlechtern sich die Lebensbedingungen und es finden immer weniger Zellteilungen statt und es verenden immer mehr Bakterien. Dies ist die Absterbephase. (Durch Überbevölkerung und Abgabe der Stoffwechselgifte sterben die Bakterien an Umweltvergiftung im eigenen Müll.)
    Wie kann man experimentell so eine Wachstumskurve erstellen?
     
     

    Phagen-Plaque-Zähltest

    Phagen sind so klein, daß man sie nicht im Lichtmikroskop sehen kann. Sie vermehren sich auch nicht auf Bakteriennährböden und bilden somit keine Kolonien. Wohl vermehren sie sich in Bakterien.
    Um sie nachzuweisen, bringt man sie möglichst in geringer Anzahl auf Bakterienrasen (oder plattiert sie zusammen mit Bakterien aus einer Übernachtkultur), wo jeder Phage zunächst ein Bakterium befällt und lysiert. Daraufhin werden die Nachbarbakterien befallen, lysiert, bis schließlich so viele Bakterien im Rasen lysiert sind, daß man das Fehlen der Bakterien wie negative Kolonien, wie Löcher im Bakterienrasen, also Plaques, sehen kann.
    Beim Phagen-Plaque-Zähltest kommt es auch auf die richtige Verdünnung an, ähnlich wie beim Bakterien-Kolonien-Zähltest.
    Gibt man einer Bakterienkultur Phagen zu, so sieht die Bakterienkultur wie üblich trüb aus und wird, nachdem die Bakterien lysiert sind, klar. Will man den Phagen-Titer dieser Lösung bestimmen, so führt man wieder Verdünnungsreihen durch und plattiert vom letzten Verdünnungsschritt 1 ml zusammen mit 1 ml einer Bakteriensuspension, die den Rasen bilden soll. Nach dem Bebrüten der Platten kann man die Plaques auszählen und die Phagen-Konzentration in der ursprünglichen Lösung berechnen.
     
     
    Wie groß war der Verdünnungsfaktor im Beispiel für die ganz rechte Platte?
    Wie viele Phagen waren in 1 ml der ursprünglichen Phagensuspension, wenn wir auf der letzten Platte ca. 45 Plaques zählen?


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