1.3 Eigenschaften der Blattfarbstoffe (Fortsetzung)  
1.3.2 Herstellung und Chromatographie eines Blattextraktes  

Zunächst wollen wir uns einen Blattextrakt herstellen.

Herstellung eines Blattextraktes


Gras-
oder Brennesselblätter werden mit der Schere fein zerschnitten und auf nassem Filterpapier 1 Nacht aufbewahrt. Am nächsten Tag werden die Schnipsel in mehreren Portionen in einen Mörser gegeben. Dazu gibt man genügend Spiritus und zerreibt das Gemisch mit Sand. Dadurch werden die Zellen und Chloroplasten aufgebrochen und das Chlorophyll extrahiert. Die grüne Spirituslösung wird in einen mit Papierfilter belegten Glaszylinder gegeben mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Diese Prozedur wiederholt man, bis genügend Rohchlorophylllösung hergestellt wurde um den Enghalsrundkolben vollständig zu füllen.


Material:

  • 2 Hände voll Gras oder Brennessel
  • Schere
  • Bechergläser
  • Spiritus
  • Sand
  • Mörser
  • Wasserstrahlpumpe
  • Glastrichter + Papierfilter
  • kleiner Enghals- Rundkolben

Auswertung/Beobachtung:

Hält man nun den Kolben mit dem Extrakt vor einen Tageslichtprojektor, so erscheint die Rundung des Kolbens dunkelrot, der Hals grün. die jederman sichtbare Chlorophyllösung erscheint außerhalb der natürlichen Umgebung plötzlich mal rot, mal grün.

Die Antwort liegt nicht unbedingt auf der Hand. Betrachten wir noch einmal das Absorptionsspektrum des Chlorophylls. Blau und Rot werden aborbiert, Grün nur wenig. In der Kolbenrundung ist die Schichtdicke jedoch so groß, daß dei Grünabsorption sich aufsummiert, d.h. jedes Chl - Moleküle absorbiert ein wenig Grün. Da so Blau, Grün und Rot absorbiert werden, erscheint uns die "dicke" Lösung dunkelrot.

Um zu entscheiden, mit welchen Farbstoffen man es zu tun hat, trennen wir den Blattextrakt durch Chromatographie auf.

Chromatographie eines Blattextraktes

Dies kann man entweder mit einer Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten oder mit Papierchromatographie erreichen. Zur Verhinderung der Oxidation wird eine Spur Ascorbinsäure dazugegeben. Als Laufmittel verwendet man eine Gemisch aus

10 ml Benzin, 5 ml Petrolether und 4 ml Aceton.

Die Lösung wird aufgetüpfelt und abgedunkelt ca. 50 Minuten laufengelassen.

Ergebnis:

Man erhält fünf bis 6 farbige Banden, die unter UV-Licht alle fluoreszieren.

Die Trennung kann auch mit Tafelkreide demonstriert werden.

Runde Tafelkreide muß 1 Std bei 100°C getrocknet werden. Dann wird die abgekühlte Kreide senkrecht in ein Becherglas gestellt, das 5 mm hoch mit der Blattextrakt-Lösung gefüllt ist. Wenn der Extrakt ca. 1 cm hoch gestiegen ist, wird die Kreide in ein 100 ml Becherglas gestellt, das mit der obigen Laufmittelmischung 5 mm hoch gefüllt ist. Nach gut sichtbarer Trennung der Banden betrachtet man die Kreide unter der UV-Lampe.

Kurzer Überblick über die Chromatographie

Unter dem Begriff Chromatographie werden eine Reihe mikroanalytischer Trennverfahren zusammengefaßt, die zur Abtrennung einzelner Verbindungen aus einem vorgegebenen Substanzgemisch dienen. Erfinder des Verfahrens und des Begriffs ist der russische Botaniker Tswett (Abb. 25) der 1903 als erster mit einer Kalksäule Blattpigmente trennte.

Man kennt heute verschiedene Verfahren wie die Dünnschichtchromatographie (DC) die Gaschromatographie (GC), die Hochleistungsflüssigkeitschromato-graphie (HPLC) oder die sich heute immer mehr durchsetzende Gaschromatographie gekoppelt mit massenselektivem Detektor (GCMSD).

 

Üblicherweise führt man die zu trennenden Teilchen ( mobile Phase) über ein anderes, unbewegliches Material (stationäre Phase). Die Teilchen der beweglichen Phase interagieren auf verschiedene Weise mit dem Trägermaterial, was zu einer Auftrennung führt. Dazu können verschiedene Trägermaterialien verwendet werden wie z. B.

  • Glasplatten beschichtet mit Silikagel bei der Dünnschichtchromatographie oder
  • Papier bei der Papierchromatographie,
  • Gase bei der Gaschromatographie und
  • Flüssigkeiten mit hydrophilen und unlöslichen Bestandteilen bei der Flüssigkeitschromatographie.

Die Auftrennung erfolgt nach

  • unterschiedlicher Teilchengröße
  • unterschiedlicher Ladung oder
  • unterschiedlicher Affinität zum Trägermaterial.

Dünnschichtchromatographie

Bei der Dünnschichtchromatographie wird das zu trennende Gemisch als kleiner Fleck auf das Trägermaterial aufgebracht. Die Komponenten können gegenüber ebenfalls aufgetragenen Standards identifiziert werden. Eine Seite der Platte wird dann in ein Laufmittel becken gebracht. Das Laufmittel saugt sich aufgrund der Kapillarität durch das Trägermaterial und führt das zu trenende Gemisch mit sich. Dabei haben die zu trennenden Bestandteile unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit. Nach einer gewissen Zeit liegen die Bestandteile in unterschiedlichen Bereichen der Platte vor (Banden). Sie werden durch UV oder Versatz mit Indikatoren wie Jod nachgewiesen.

Die chromatographischen Daten, die eine Substanz charakterisieren, sind der Rf-Wert bei der DC bzw. die Retentionszeit (tr) bei der HPLC oder GC. Die Retentionszeit (in Minuten) ist die Zeit, die ein Stoff benötigt, um durch eine Trennsäule hindurchzuwandern. Sie wird zur qualitativen Beschreibung des Trennvorgangs aus dem Chromatogramm bestimmt. Der Rf-Wert ist der Quotient aus der Laufstrecke der Substanz zur Laufstrecke des Fließmittels (Lösungsmittels):

Rf = Laufstrecke Probe / Laufstrecke Fließmittel

 

Auswertung und Erklärung der obigen Experimente

Der Blattextrakt im Enghalsrundkolben fluoresziert (leuchtet) bei intensiver Belichtung dunkelrot.

Was ist Fluoreszenz/Phosphoreszenz?

Fluoreszenz nennt man das Phänomen, bei dem die Lichtabsorption durch einen bestimmten Stoff ( Fluorochrom) nach einigen Pico- oder Nanosekunden eine Emission (Abstrahlung) von Licht längerer Wellenlänge zur Folge hat. Man nennt die Gesamtheit der Wellenlängen, die Fluoreszenz hervorruft Fluoreszenz-Anregungs-Spektrum. Die Gesamtheit der emittierten (ausgesandten) längerwelligen Wellenlängen nennt man Fluoreszenz-Emissions-Spektrum. (Das Licht der Leuchtstoffröhren beruht auf Fluoreszenz).

Ist die Emission zeitlich verzögert ( ms, Min.), so spricht man von Phosphoreszenz. Das Polarlicht (Abb. 27) und das Bild auf einem Computermonitor ist z. B. auf Phosphoreszenz begründet.

Phosphoreszenz und Fluoreszenz faßt man zur Photolumineszenz zusammen. Beide hängen vom Energiezustand des Stoffes (Atoms, Moleküls usw. ) ab. Den quantitaiven Zusammenhang zwischen der Absorption und Konzentration des absobierenden Stoffes gibt das Lambert-Beersche Gesetz.

Die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts ist eine lineare Funktion der Fluorochromkonzentration. Diese Eigenschaft von Stoffen wird in der Fluoreszenz-Spektroskopie ausgenützt, um sie qualitativ oder quantitativ zu untersuchen

in vivo = im lebenden Organismus

in vitro = außerhalb des lebenden Systems

Um die in vitro-Fluoreszenz von Chlorophyll zu erklären, wollen wir zunächst das Bohrsche Atommodell bemühen, um das Prinzip zu verstehen.

Stoffe bestehen aus Molekülen, Ionen oder Atomen. Diese wiederum bestehen aus Atomkern und Elektronenhülle. Photoluminiszenz hat nur mit den Elektronen zu tun. Was geschieht, wenn diese von Licht getroffen werden, sieht man auf der nachfolgenden Abbildung.

Das vom Photon einer bestimmten Wellenlänge getroffene Elektron übernimmt die Energie und wird aus seinem Grundzustand ( S0 ) auf eine angeregte Energiestufe ( S1) gehoben. Fällt es wieder zurück, sendet es Licht (Strahlung) aus. Jedes Atom oder Molekül hat mehrere Anregungszustände.

Je höher die Energie des eingestrahlten Lichts, desto weiter wird das Elektron angehoben und desto kurzlebiger ist der angeregte Zustand. Besonders leicht beweglich sind die p - Elektronen z. B. der Doppelbindungen. Betrachten Sie sich noch einmal die Strukturformeln von Chlorophyll und der anderen Pigmente, so finden Sie immer ein p- Elektronensystem.

Stellvertretend für die anderen Pigmente wollen wir die Anregungszustände von Chlorophyll betrachten.

Chlorophyll besitzt mehrere Anregungszustände:

  • S1 = 1. angeregter Singulettzustand
  • S2 = 2. angeregter Singulettzustand und
  • T1 = 1. angeregter Triplettzustand

Jeder Energielevel besitzt noch sogenannte Feinenergieabstände. Um eine Elektron auf den Zustand S1 anzuheben, ist eine bestimmte Energie
 E Abs notwendig. Enthält das anregende Licht etwas mehr Energie als notwendig, wird das Elektron auf dieser angeregten Stufe in Schwingungen versetzt, bei noch mehr Energie in Rotationen.

Energie Abs > Energie Flu ; l Abs < l Flu (Stokes-Verschiebung)

Aus der Absorptionskurve des Chlorophyll erkennen wir, daß dieses blaues und rotes Licht absorbiert. Blaues Licht hebt ein getroffenes Elektron auf den S2-Zustand, rotes Licht in den S1-Zustand. Der S2-Zustand ist jedoch zu kurzlebig und das Elektron fällt auf den S1-Zustand zurück unter Abgabe von Wärme. Vom S1-Zustand kehrt das Elektron in den Grundzustand unter Aussendung von rotem Fluoreszenzlicht zurück. Unter bestimmten Umständen kann das Elektron aus dem S1-Zustand unter Wärmeabgabe auf den T1-Zustand fallen und dann unter Aussendung von längerwelligem Phosphoreszenzlicht in den Grundzustand zurückfallen.

Die Rotfluoreszenz von Chlorophyll erklärt sich also dadurch, daß blaues und rotes absorbiertes Licht immer zur Rotfluoreszenz oder dunkelroter Phosphoreszenz führen.

In vitro findet man für Chlorophyll a eine Fluoreszenzbande bei ca. 669 nm ( in Ether) und eine Phosphoreszenzbande bei 755 nm. In vivo wurde schwache Fluoreszenz und keine Phosphoreszenz nachgewiesen.

Im nächsten Kapitel werden wir feststellen, woran das liegt und was mit der absorbierten Energie in vivo geschieht.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 23

Lichabsorption einer Rohchlorophyllösung


 

Abb. 24

DC-Chromatographie eines Blattextraktes


Rohchlorophyllösung

1. Mischung von Chlorophyll/Carotin in Petroleumbenzin
2-4. Schrittweise Reinigung (Petroleum- benzin)

C. gereinigte Lösung von Carotin in 90% Methanol

 

Abb. 25

Mikhail S. Tswett
Rußland
( 1872 - 1919)

Entdecker der Chromatographie

Trennung der Blattfarbstoffe durch Tafelkreide

 

 

Abb. 26

Methoden der Chromatographie

Säulenchromatographie

- Dünnschichtplatten -
Trägermaterialen bei Dünnschichtchromatographie

 

 

 

 

 

 

Abb. 27

Polarlicht

Fluoreszenzspektroskopie

Oben Gehirnzellen, die mit einem Farbstoff gefärbt und mit fluoreszierenden Antikörper besetzt sind. Die Aufnahme wurde mit einem speziellen Laser-Mikroskop (CLSM) gemacht.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 28

Absorption und Emission bei Atomen

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb. 29

Anregungszustände des Chlorophyll

 

 

 

 

Weiterführende Quellen:

Botanik:

http://www.uni-hamburg.de/~biologie/b_online/d00/inhalt.htm

Alles über die Photosynthese

http://photoscience.la.asu.edu/photosyn/default.html

Lichtreaktion

http://esg-www.mit.edu:8001/esgbio/ps/light.html

Tutorial Chromatographie

http://www.gene.com:80/ae/TSN/SS/chromatography_index.html

Chromatographie

http://www.rocler.qc.ca/pdubreui/chimie_c.htm
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/

Simulation Dünnschichtchromatographie

http://macweb.acs.usm.maine.edu/tanes/tlc.html

Flüssig-Chromatographie

http://hplc.chem.vt.edu/my_home/book/content/gen_fram.html

Fluoreszenz-Spektroskopie

http://hendrix.pharm.uky.edu/che626/XRF/history.html
http://phys.educ.ksu.edu/vqm/html/fluorescence.html

Polarlicht

http://rigel.rice.edu/~freeman/dmb/spwea.html

Fluoreszenz und Phosphoreszenz

http://www.research.microsoft.com/glassner/work/projects/flu/flu.htm

Photosynthese  

http://www.emc.maricopa.edu/bio/bio181/BIOBK/BioBookPS.html