Bevor sich eine Zelle teilt, muß sie ihre gesamte DNA verdoppeln (= replizieren). In Eukaryonten geschieht das in der S-Phase des Zellzyklus. Der Replikation genannte Vorgang vollzieht sich gleichzeitig an mehreren Stellen des Riesenmoleküls DNA. Dabei entstehen durch das Aufschrauben sogenannte Replikationsblasen. Dort arbeiten 2 enzymatische Replikationskomplexe in entgegengesetzter Richtung. Neben dem Enzym Helicase, das die Doppelhelix entschraubt, enthält der Replikationskomplex Gyrase, verschiedene Proteine, Primase und verschiedene DNA-Polymerasen. Die Replikation verläuft in beiden Richtungen bis sich die Blasen treffen.

Der sehr komplizierte und energieverbrauchende Vorgang läuft vereinfacht in 3 Schritten ab:

1. Entwindung und Stabilisierung der DNA
2. Synthese eines komplementären DNA-Stückes in 5´-3´-Richtung am Führungsstrang
3. Synthese von Okazaki-Fragmenten und deren Verbindung in 5´-3´-Richtung am anderen Strang

1 Initiatorproteine binden an die DNA.Das Enzym Helicase bindet an die Proteine und entschraubt an der Stelle die Doppelhelix. Die Gyrase und Proteine stabilisieren die entwundenen Einzelstränge. 2 Die Primase synthetisiert ein Stück komplementäre RNA-Nukleotide in 5´-3´-Richtung, kurz Primer genannt. Nun bindet ein Molekül DNA-Polymerase an den Primer und synthetisiert in 5´-3´-Richtung mit Hilfe von Nukleotidtriphosphaten (dNTP) kontinuierlich einen Komplementärstrang, der sich zur Helix formt. (= Führungsstrang) 3 Da die DNA Synthese nur in 5' - 3' ablaufen kann, wird ein zweites DNA Polymerase- Molekül benutzt, um an den anderen DNA-Strang zu bilden.

Auch hier werden wieder Primer verwendet. Die DNA-Polymerase synthetisiert mehrere kleine komplementäre Polynukleotidsequenzen genannt Okazaki-Fragmente. Eine zusätzliche Polymerase ersetzt die RNA-Primer durch DNA und ein weiteres DNA-Polymeraseenzym prüft, ob bei der Synthese keine Fehler gemacht wurden. Danach verknüft dann die DNA-Ligase die Okazaki-Stücke zu einem kompletten Strang.

Geschwindigkeit der Synthese

Bei Prokaryonten ca. 1000 Nukleotide/Sekunde; d.h. bei E.Coli mit 4,7 x 10⁶ Basenpaaren dauert die Replikation 40 Minuten.

Eukaryonten:
Das typisch menschliche Chromosom hat ca. 150 x10⁶ Basenpaare. Die Synthese schreitet mit ca. 50 Nukleotiden/Sekunde voran. Dies würde einen Monat dauern, gäbe es nicht gleichzeitig mehrere Replikationsblasen. So dauert es nur eine Stunde. Die gesamte DNA mit 6 x 10⁹ Basenparen wird in mehreren Stunden verdoppelt.

Die Arbeit der Enzyme kann man in der obigen und nebenstehenden Abbildung nachvollziehen. Bei der Replikation der ringförmigen DNA in Prokaryonten findet man nur eine Replikationsblase.

Semikonservative Replikation

Die oben beschriebene Art der Replikation wird von allen Organismen durchgeführt. Dabei wird jeweils einer der alten DNA-Stränge komplett belassen und ein komplett neuer komplementärer Strang synthetisiert. Man nennt diese Methode semikonservative Replikation. Matthew Meselson and Franklin W. Stahl entwarfen 1958 ein Experiment, um zu entscheiden, wie die DNA sich repliziert. Schon WATSON und Crick hatten die semikonservative Replikation postuliert. Diese wurde dann auch bewiesen.

• Meselson und Stahl kultivierten E.Coli-Bakterien auf einem Nährboden, der als Stickstoffquelle ¹⁵N hatte. Die Bakterien bauten diesen in alle stickstoffhaltigen Stoffe ein, also auch in die DNA. Isolierte man die DNA und zentrifugierte sie im CsCl-Dichtegradienten bei 100000g, so ergab sich an einer bestimmten Stelle eine Bande der schweren DNA im Zentrifugenbehälter.
• Die Zentrifugation von DNA von Bakterien, die auf ¹⁴N gewachsen waren ergab ein Bande leichter DNA an einer anderen Stelle.
• Nun brachte man die ¹⁵N-Bakterien auf Nährboden mit ¹⁴N, also mit normalen Stickstoffquellen und ließ sie 1 Zellteilung durchführen. Wieder wurde die DNA der Bakterien analysiert und zentrifugiert. Es gab nur eine halbschwere Bande, die genau in der Mitte der beiden ersten Banden lag. Das Ergebnis nach 2 Zellteilungen ergab zur Hälfte leichte und halbschwere DNA, nach 3 Generationen 3/4 leichte und 1/4 halbschwere DNA.

Dieses Ergebnis konnte nur durch semikonservative Replikation der Bakterien-DNA erklärt werden.

Das Experiment ist auf der nachfolgenden Tafel zusammengestellt:

Ein Shockwave-Animation der Replikation ist hier zu sehen:
http://www.ncc.gmu.edu/users/ypetty/repanim.htm

Zentrifugation Eine Zentrifuge ist ein Gerät, um Teilchen aus einer Lösung gemäß ihrer Größe, Form und Dichte und der Viskosität des Mediums und Rotorgeschwindigkeit zu trennen. In der Biologie sind das Zellen, Organellen, Viren und große Moleküle wie Nukleinsäuren und Proteine. Die Grundlagen der Sedimentation gehorchen dem Stokeschen Gesetz. Es gibt verschiedene Formen der Zentrifugation. Bei der Dichtegradienten-Zentrifugation wird das Partikelgemisch in Banden aufgetrennt. Die Sedimentationsgeschwindigkeit unter definierten Bedingungen wird als Sedimentationskoeffizient nach Svedberg angegeben (s). Dabei gilt: d = Moleküldichte do = Dichte des Gradienten; r = Molekülradius S = Sedimentationskoeffizient oder 10-13 sec; C = Zentripetalkraft V = Sedimentationsgeschwindigkeit; n = Viskosität des Mediums Bei Proteinen ist s < 20, Ribosomen der Eukaryonten besitzen s = 80 (oder 80s), s Influenza-Virus = 600 und s Mitochondrien > 8000.