Die Entwicklung der Segmentierung bei Drosophila und deren Genetik

Einleitung und frühere Untersuchungen

Abb. 1 Abgelegtes Ei (nur 1 Zelle) in dem man sich teilende Kerne sieht. In den ersten Stunden der Entwicklung nach der Eiablage finden 13 Zellkernteilungen statt, ohne dass sich die Zelle teilt (Es entsteht also ein Syncytium vor). Dieses Stadium wird daher syncytiales Blastoderm genannt. (s. Abb.1 in Aufg. zur Furchung bei Drosophila). Bis zum Zeitpunkt des Blastoderms, an dem die Kerne von Membranen umgeben werden, und sich damit Zellen bilden, gibt es kein äußeres Anzeichen einer Segmentierung (s. Abb.2 in Aufg. zur Furchung bei Drosophila). Trotzdem läßt sich zeigen, dass die Zellen schon in Bezug darauf, welches Segment sie später bilden werden, determiniert sind. Experimente aus den 60er und 70er Jahren, die lokalisierte Strahlung, Abschnürungen, Ausfließen von Cytoplasma und Transplantationen angewendet haben, legten nahe, dass es lokalisierte Faktoren im Cytoplasma am vorderen und hinteren Eipol gibt, die diese Determination bewirken.

Die aufgeführten Experimente brachten folgende Ergebnisse:
1. lokalisierte Bestrahlung des vorderen Eipols führt zum Verlust des Kopfes und zu Larven, die zwei Abdomen haben, die spiegelbildlich angeordnet sind (s. Abb.2 in Aufg. zu bcd-Mutation),
2. Abbindungsexperimente zeigten, dass die Entwicklung mittlerer Embryoteile von Substanzen abhängt, die an den vorderen und hinteren Eipolen lokalisiert sind,
3. Cytoplasmaausflüsse und Transplantationen von Cytoplasma an verschiedene Stellen zeigten, dass am vorderen und hinteren Eipol Substanzen lokalisiert sind, die die globale Entwicklung des Embryos beeinflussen.
Eine der Hypothesen war, dass diese Determinanten durch den Embryo diffundieren könnten und so einen Konzentrationsgradienten ausbilden könnten. Weiter spekulierte man, dass es Konzentrationsschwellen geben könnte, die für die Determination der verschiedenen Zellschicksale zuständig sein könnten. Diese Hypothesen haben starke Kontroversen ausgelöst, aber es häufen sich die Belege dafür, dass das Modell der Wahrheit entspricht.

Maternale Gene

Die Mutter muss dem Ei viele Stoffe mitgeben. So ist klar, dass alle Prozesse, die im Ei vor der Vereinigung der beiden Vorkerne ablaufen von Enzymen katalysiert werden müssen, die dem Ei von der Mutter mitgegeben wurden. Auch nach der Vereinigung der beiden Vorkerne wird das Erbgut der Zygote nicht sogleich aktiv. Die Gene, die Stoffe bilden, die die Mutter dem Ei mitgeben muss, bis das Erbgut der Zygote selbst aktiv werden kann, nennt man maternale Gene. So kann es z.B. sein, dass die Mutter ein homozygot defektes Gen besitzt, das sehr wichtig für die Entwicklung des Eis ist. Dann stirbt das Ei also ab. Die Mutter ist unfruchtbar.
Bildet die Zygote selbst Stoffe, z.B. Proteine oder Enzyme, die für seine weitere Entwicklung von Bedeutung sind, dann spricht man von zygotischen Genen.

Genetische Screens für maternale Gene

Es waren einige Mutationen bekannt, die die frühe Entwicklung des Eis und die Segmentierung der Larve beeinflussen konnten. Das inspirierte Christiane Nüsslein-Volhard und Eric Wieschaus dazu in den späten 70er Jahren groß angelegte genetische Screens durchzuführen, die darauf abzielten, alle maternalen und zygotischen Gene zu finden, die die Segmentierung der Larve beeinflussen konnten. Ihre Mutantensuche war sehr erschöpfend (man spricht auch von Sättigungsmutagenese, was ihnen später den Nobelpreis einbrachte) und führte zur Identifizierung von über 100 Genen, die verschiedene Aspekte der embryonalen Entwicklung beeinflussten. In Bezug auf die maternalen Gene wurden drei Gruppen von Genen gefunden, die Einfluss auf die Ausbildung der A-P-Achse (anterior-posterior also vorne-hinten) hatten, eine vordere, eine hintere und eine terminale Gruppe von Genen. Mutationen in Genen der vorderen Gruppe z.B. bcd oder hb verursachten eine Zerstörung vorderer Strukturen. Mutationen in Genen der hinteren Gruppe verursachten Zerstörungen hinten gelegener Strukturen, z.B. caudal, nanos und oskar. Mutationen in der terminalen Gruppe führten zu Zerstörungen an beiden Enden der Larve, z.B. torso.

Die anteriore Gruppe der maternalen Gene

Das wichtigste Gen in dieser Gruppe ist das bicoid-Gen (bcd). Man kennt viele verschiedene Mutationen dieses Gens, schwache Mutationen haben eine geringe Auswirkung auf den Phänotyp, starke Mutationen dagegen gravierende Auswirkungen. Wie Mutanten dieses Gens aussehen, kann man in meiner Aufgabe zur Untersuchung der bcd-Mutation sehen.
Schwache Mutationen von bcd ähneln dem Effekt, den Cytoplasmaausflüsse aus dem vorderen Eipol bewirken. Stärkere bcd-Mutationen führen zum Verlust der meisten anterioren Strukturen (gesamter Kopf und T1 und T2, d.h. die beiden vorderen Segmente des Thorax). Solche bcd-Mutanten können durch Cytoplasmainjektionen von vorderem Eicytoplasma geheilt werden oder durch Injektion von bcd⁺-mRNA (also vom Wildtyp). Daraus lässt sich schließen, dass dieses Gen für die Entwicklung vorderer Strukturen notwendig ist.
bcd ist ein maternales Gen. Es wird von der Mutter transcribiert und die mRNA wird in das Ei transportiert. Dort wird die mRNA am vorderen Eipol lokalisiert.

Abb. 2 Links: Selbsterklärend. Rechts: a: Lokalisation der bcd-mRNA und die Konzentration entlang der Eiachse b: Färbung des BCD-Proteins im Ei und sein Konzentrationsgradient von vorn nach hinten c: Färbung der hb-mRNA und ihre Konzentration entlang der Eiachse

Die Lokalisation der bcd-mRNA am vorderen Eipol führt dazu, dass sie nach der Eiablage sofort translatiert werden kann. Dadurch wird das BCD-Protein nur am vorderen Eipol gebildet. Es entsteht ein Konzentrationsgradient des BCD-Proteins. D.h. am vorderen Eipol liegt eine hohe Konzentration des BCD-Protein vor und von hier aus diffundiert es nach hinten. Je weiter man nach hinten geht im Ei, desto geringer wird seine Konzentration.
Das BCD-Protein ist nun ein Transcriptionsfaktor (d.h., dass es sich an die DNA bindet und dort die Transcription von Genen auslösen kann). Ein Zielgen, das vom BCD-Protein reguliert wird ist hunchback (hb), es wird von ihm dadurch aktiviert, dass das BCD-Protein an bestimmte regulatorische Sequenzen des hb-Gens bindet. hb wird im vorderen Teil des Embryos transcribiert und seine Expression hört an einer scharfen Grenze auf. Das liegt daran, dass Transcriptionsfaktoren in einer alles oder nichts Weise an die DNA binden. Daher ist bei einer bestimmten BCD-Protein-Konzentration diese nicht mehr hoch genug, dass sie die Transcription auslösen könnte (s. Abb.2). Das ist die sogenannte Schwellenkonzentration. Das wurde dadurch nachgewiesen, dass bei erhöhter Anzahl der bcd-Kopien im Genom hb bis zu einer weiter nach hinten liegenden Grenze exprimiert wird.
Es gibt Bindungsstellen mit hoher und solche mit niedriger Affinität für das BCD-Protein. Das nutzten Nüsslein-Volhard u.a. aus und zeigten, dass Reportergene die nur schwache Bindungsstellen besaßen, eine hohe Konzentration benötigten, um aktiviert zu werden. Dadurch werden sie nur in einem schmaleren Streifen exprimiert. Dagegen werden sie in einem breiten Streifen aktiviert wenn sie hochaffine Bindungsstellen besitzen. So wird offenbar der kontinuierliche Konzentrationsgradient vom BCD-Protein durch unterschiedliche Bindungsaffinität in eine scharfe Schwelle räumlicher Information transformiert (s. Fig. 7 in St. Johnston and Nüsslein-Volhard, 1992).

Die posteriore Gruppe der maternalen Gene

	Abb.3 Das CAUDAL-Protein bildet einen Konzentrations-Gradienten von hinten nach vorn aus.
	Abb.4 Die Konzentrationsgradienten der Proteine der angegebenen Gene. Links bei 0 befindet sich das Vorderende des Eis, rechts bei 100 das hintere Ende. Nach oben sind die relativen Konzentrationen der Proteine abgetragen.

Das wichtigste Gen der posterioren oder hinteren Gruppe maternaler Gene ist Caudal (cad). Ähnlich wie bei bcd ist, dass seine mRNA ebenfalls in der Mutter gebildet wird und in das Ei transportiert wird. Im Unterschied zu bcd wird es aber nicht am hinteren Eipol fest lokalisiert, sondern es ist gleichmäßig über das ganze Ei verteilt. Trotzdem bildet sich auch ein Konzentrationsgradient des CAD-Proteins mit hoher Konzentration am hinteren Eipol und von dort aus nach vorn abfallender Konzentration. Das hat folgende Ursache:
Ist bcd mutiert, so wird caudal gleichmäßig translatiert, was den Schluss nahe legt, dass die Translation durch das BCD-Protein verhindert wird. Es wurde dann tatsächlich nachgewiesen, dass das BCD-Protein an die 3´-UTR-Region (untranslated Region) der cad-mRNA bindet und dessen Translation blockiert.
Das BCD-Protein kann auch an verschiedene andere mRNA-Moleküle binden. Diese Aktivität ist nun wichtig für die Herstellung des Konzentrationsgradienten des Caudal-Proteins (cad, s. posteriore Gruppe). Wie oben beschrieben, ist die caudal-mRNA zunächst gleichmäßig über das Ei verteilt. Da das BCD-Protein an die mRNA von cad bindet, und dadurch deren Translation verhindert, wird im vorderen Ei durch die hohe BCD-Protein-Konzentration die Translation der cad-mRNA vollständig blockiert, weiter hinten nimmt die Blockade immer mehr ab. Daher kommt der beschriebene Gradient zustande.
Das CAD-Protein wirkt als Transcriptionsfaktor für Gene, die im hinteren Eibereich benötigt werden, z.B. für die Aktivierung der Gene knirps und giant (s. Abschnitt über gap-Gene).
Auch die nanos-mRNA wird von der Mutter gebildet und diese wird am hinteren Eipol lokalisiert. Daher bildet das zugehörige Protein ebenfalls einen Konzentrationsgradienten aus. Die nanos-mRNA verhindert die Translation der hb-mRNA, die zygotisch gebildet wird, wodurch das HB-Protein nicht im hinteren Ei gebildet wird. Ist nanos mutiert, so wird hb-mRNA im gesamten Ei translatiert während sie im normalen Embryo in der hinteren Eihälfte nicht translatiert wird. Die nanos mRNA bindet aber nicht selbst an die hb-mRNA sondern das Pumillio-Protein benötigt sie, um binden zu können. Wenn nun aber hb-mRNA im gesamten Ei translatiert wird, so reprimiert es die Transcription von knirps, was die Zerstörung des größten Teils des Abdomens nach sich zieht. Die Phänotypen von nanos- und knirps-Mutanten sind weitgehend identisch, was zeigt, dass nanos-mRNA im hinteren Teil des Eis nur dafür gebraucht wird, dass es die Translation der hb-mRNA verhindert und damit die Expression von knirps ermöglicht.
In beiden Fällen in denen die Translation kontrolliert wird (CAD durch BCD und HB durch nos/pum) fand man, dass die Repression durch cis-Sequenzen am 3´-UTR der mRNAs erfolgt. Die wichtigsten Belege dafür sind:
1. gleichmäßig über das Ei verteilte mRNAs, an deren Ende man ein 3´-UTR anhängte, wie sie hb besitzt, wurden dann nach dem hb-Muster translatiert,
2. es wurde gezeigt, dass BCD- bzw. PUM-Protein das 3´-UTR in vitro binden können.
Die Wirkung der maternalen Gene erfolgt in der Phase des syncytialen Blastoderms. Wenn das Cytoblastoderm gebildet wird übernimmt das zygotische Genom die Verantwortung für die weitere Entwicklung. Die Aktivierung der zygotischen gap-Gene hängt von Kombinationen der maternalen Gene ab.

gap-Gene

Die Expression der gap-Gene beginnt nach der letzten Teilung im Syncytium. Alle 5 gap-Gene (hb, Kr, kni, gt, cad) werden aktiviert. Die Gene hb und cad sind sowohl maternale Gene als auch zygotisch exprimierte gap-Gene. Sie heißen gap-Gene, weil bei Mutationen dieser Gene Lücken in der Segmentierung auftreten. Es fehlen mehrere Segmente (s. Aufgabe zu den gap-Genen). Alle 5 Gene codieren Transcriptionsfaktoren. Das bedeutet, dass sie bestimmte Gene aktivieren oder reprimieren.

Abb.5 Links: Expressionsbereiche von hunchback und giant. Mitte: Expressionsbereiche von Krüppel, knirps und tailless. Rechts: Expressionsbereich von Krüppel.

Pair-rule-Gene

Kombinationen von maternalen und gap-Gen-Proteinen aktivieren nun ihrerseits Pair-rule-Gene, die ebenfalls Transcriptionsfaktoren codieren. Der Name soll andeuten, dass sie in jedem zweiten Segment bzw. Parasegment exprimiert werden. Insgesamt werden 7 Streifen gebildet. Das Gen even-skipped (eve) z.B. wird in den geradzahligen Parasegmenten, das Gen fushi-tarazu (ftz) in den ungeradzahlen Parasegmenten exprimiert. Damit wird eine weitere Untergliederung des Körpers erreicht.

Abb.6 Links: Expressionsmuster des fushi-tarazu-Proteins (ftz) Rechts: Bereiche, in denen Defekte auftreten, wenn das ftz-Gen homozygot mutiert ist.

Segmentpolaritätsgene-Gene

Von den pair-rule-Genen werden nun die Segmentpolaritätsgene aktiviert. Sie bilden 14 Expressionsstreifen und unterteilen die Längsachse des Körpers von Drosophila endgültig in Segmente (bzw. Parasegmente, der Begriff soll hier nicht näher erläutert werden). Genauere Ausführungen sollen hier aber dazu nicht gemacht werden. Lediglich wird das Expressionsmuster von engrailed als Beispiel gebracht (s. Abb.7).

Abb.7 Die Larve befindet sich im gestreckten Keimbandzustand. Es sind 14 Streifen erkennbar, in denen das Gen engrailed (en) exprimiert wird.

Hox-Gene

Bei Drosophila werden im Allgemeinen 8 Hoxgene unterschieden. Diese werden in der folgenden Abb. dargestellt und in welchen Segmenten sie exprimiert werden. Zen, das in der Abb. mit geführt wird, wird bei Drosophila im Allgemeinen nicht zu den Hox-Genen gerechnet. Es ist hier dennoch aufgeführt, weil es sich an dieser Stelle im Erbgut befindet und weil es mit den Genen der Hox-Klasse-3 eng verwandt ist.

Abb.8 Im Kopfbereich wirken die Gene labial (lab), proboscipedia (pb), (zen), Deformed (Dfd) Im Thorax ist Sex combs reduced (Scr) für T1, Antennapedia (Antp) für T2 und Ultrabithorax (Ubx) für T3 zuständig. Das Abdomen wird durch die Gene Ubx, AbdomenA (abdA) und AbdomenB (AbdB) differenziert.

Zusammenfassung

Abb.9 Am vorderen Eipol wird durch die Expression des maternalen Gens bcd ein Konzentrationsgradient erzeugt. Die gap-Gene hb und kni werden aktiviert. Weiter werden der Körper durch die pair-rule-Gene (hier eve und ftz) unterteilt. Schließlich werden die Segmentpolaritätsgene und die Hox-Gene aktiviert. Die Hox-Gene sind für die Determination bestimmter Segmente notwendig.

Quellen:
Gilbert, S. F., Developmental Biology, Sinauer, Sunderland, 2000 (6.th ed.)
Kalthoff, K., Analysis of Biological, Mc Graw Hill, New York, 1996
Wilkins, A.S., The Evolution of Developmental Pathways, Sinauer, Sunderland, 2002
Wolpert, L. u.a., Principles of Development, Oxford University Press, 1998

Kontakt:: Kontakt: Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de
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