Frühe Entwicklung und embryonale Stammzellen bei der Maus und beim Menschen

Nach der Befruchtung sind oft mütterliche Faktoren für die Entwicklung zuständig. Bei Maus und Mensch ist das auch so. Der Übergang dazu, dass der Embryo seine eigenen Gene benutzt, liegt hier im 8-Zellen Stadium, das am dritten Tag nach der Befruchtung erreicht wird. Man kann das dann daran erkennen, dass sich die Zellen eng zusammen lagern, was man compaction nennt. Dieser Prozess findet zwischen dem 3. und 4. Tag statt. Diese Zellen sind natürlich totipotent. Zu diesem Zeitpunkt ändert sich dann auch die Ernährungsweise des Embryos, er beginnt mit der Verwendung  von Glucose. Auf den Zelloberflächen erscheint ein Glucose-Rezeptor Glut-8, mit dem die Zellen Glucose aus dem Medium aufnehmen können. Vorher hatte er für seine Energieversorgung Lactat und Pyruvat verwendet.
Im 16-Zellen-Stadium (jetzt Morula genannt) findet dann eine Differenzierung zwischen Trophoblastzellen und innerer Zellmasse statt. Wie man dann bei der Maus feststellen kann, können erstere Zellen nicht von den embryonalen Stammzellen gebildet werden. Daher nimmt man an, dass das beim Menschen ebenso ist. Bewiesen ist das nicht. Es könnte sich später also theoretisch herausstellen, dass die embryonalen Stammzellen des Menschen doch Trophoblastzellen bilden können, dann würden sogar die embryonalen Stammzellen unter das Embryonenschutzgesetz fallen !
Danach bildet sich die Blastocoelhöhle aus. Es entsteht die innere Zellmasse. Die Zellen der inneren Zellmasse stehen in Wechselwirkung mit den Trophoblastzellen. Das kann man daran erkennen, dass sie FGF-4 (fibroblast-growth-factor) abgeben, die Trophoblastzellen aber nicht. Sie unterscheiden sich dadurch, dass die Trophoblastzellen flacher und polarisiert sind, während die Zellen der inneren Zellmasse symmetrisch und rundlich sind.
Kurz vor der Implantation schlüpft die Blastocyste aus der Zona pellucida. Sie besteht jetzt also aus dem Trophoblasten, der inneren Zellmasse und dem Blastocoel. Die Zellen der inneren Zellmasse können in diesem Stadium als embryonale Stammzellen (ES-Zellen) verwendet werden.
Kurz nach der Nidation (Einnistung) bildet sich aus der inneren Zellmasse der Hypo- und der Epiblast. Der Embryo wird nur aus dem Epiblasten gebildet, während der Hypoblast extraembraonales Gewebe bildet, das der Ernährung des Embryos dient. Die Zellen des Epiblasten sehen den embryonalen Stammzellen auch sehr ähnlich sie sind aber nicht vollständig identisch.
Aus dem Epiblasten geht dann das primäre Ektoderm hervor, aus dem sich dann während der Gastrulation die drei Keimblätter Endo-, Meso- und Ektoderm bilden.
Noch vor der Bildung der drei Keimblätter werden die primordialen Keimzellen (PG-Zellen) gebildet und abgesondert. Sie wandern aus und wandern später in die Keimdrüsenleiste ein. Dort bilden sie später die Oogonien oder die Spermatogonien. In diesen Keimzellen-Mutterzellen (PG-Zellen) wird die genomische Prägung aufgehoben, d.h. diese Zellen sind nicht mehr geprägt. Deshalb dürfte es bei der Verwendung dieser Zellen im Sinne von Stammzellen Schwierigkeiten geben, denn die genomische Prägung kann nicht künstlich herbeigeführt werden.
Es scheint ein sehr wichtiges Merkmal undifferenzierter pluripotenter Zellen zu sein, dass sie das Gen Oct-4 exprimieren und somit das Protein OCT-4 bilden. Durch die Anwesenheit dieses Proteins wird bewirkt, dass sich die Zellen weiter teilen und dass sie in einem undifferenziertem Zustand bleiben. Das Gen wird nun sowohl von den Zellen der inneren Zellmasse als auch die PG-Zellen exprimiert. Die Trophoblastzellen tun das nicht. OCT-4 ist ein Transcriptionsfaktor, das heißt ein Protein, das an DNA bindet und Gene an- oder abschalten kann. Wie man festgestellt hat, wird durch dieses Protein z.B. das Gen zur Bildung von FGF-4 angeschaltet.

Kultivierung von embryonalen Stammzellen

Bisher ist es nur bei drei Arten gelungen embryonale Stammzellen in Kultur zu halten, d.h. in vitro zu kultivieren und sich weiter teilen zu lassen, bei der Maus, beim Rhesusaffen und beim Menschen. Bei der Maus hat sich außerdem herausgestellt, dass die Entnahme von embryonalen Stammzellen und deren Kultivierung bei verschiedenen Stämmen von Mäusen unterschiedlich schwierig ist und unterschiedlich erfolgreich. Der Stamm 129 ist am besten geeignet. Der zweite geeignete Stamm ist C57BL/6. Dieser ist aber wesentlich unzuverlässiger als der Stamm 129. Daran läßt sich schon ablesen, dass man bisher sehr wenig darüber weiß, welche Kulturbedingungen für die Vermehrung und das Wachstum embryonaler Stammzellen nötig sind und dass man die Bedingungen, die angewandt werden auch nicht versteht. Das was man darüber weiß ist, dass embryonalen Stammzellen der Maus auf MEF-Zellen (mouse-embryonal-fibroblast cells) wachsen und im undifferenziertem Zustand verbleiben. Das liegt daran, dass diese Zellen den LIF (leucemia-inhibitory-factor) abgeben. Man kann diesen Faktor auch dem Medium zugeben, dann hat das denselben Erfolg bei Mäusen. Die Zellen wachsen dann im Medium ohne sich an eine Unterlage anzuheften. Bei menschlichen embryonalen Stammzellen geht das nicht. Warum es diesen Unterschied zwischen menschlichen und Mäuse-Stammzellen gibt, weiß man nicht.
Ein ganz wesentliches Merkmal embryonaler Stammzellen ist, wie schon oben erwähnt, dass sie das Gen Oct-4 exprimieren und dass auch EC-Zellen (embryonal-carcinoma-cells) und PG-Zellen dieses Gen exprimieren. Zusätzlich  kennt man inzwischen eine Reihe von Markern auf der Oberfläche von Zellen die sie als undifferenzierte Zellen kennzeichnen. Einige davon seien exemplarisch in der nachfolgenden Tabelle genannt.

Tabelle: Vergleich von Maus, Affe und Menschlichen pluripotenten Stammzellen (nur einige Beispiele)

Anwendungen embryonalen Stammzellen

Bei der Maus ist es schon gelungen, durch Manipulation der Wachstumsbedingungen, verschiedene Zelltypen herzustellen (s.u.). Trotzdem muss man hier festhalten, dass diese Erfolge durch Probieren erzielt wurden und dass man den Hintergrund, nämlich was die Zugabe der Wachstumsfaktoren bewirkt, nicht versteht. Man weiß auch nicht, warum man welche Wachstumsfaktoren zugeben muss. Niemand weiß bisher welche Gene dadurch an- und abgeschaltet werden und welche Signaltransduktionswege benutzt werden oder welche Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen dadurch auftreten.
Durch solche Manipulationen kann man aus Stammzellen der Maus in vitro Gefäßzellen, Neurone, die Dopamin und Serotonin bilden und Langerhanssche Inselzellen herstellen, die dann in vivo funktionieren. In all diesen drei Fällen dienen die gleichen Stammzellen als Ausgangsmaterial, ihre Differenzierung wird dadurch eingeleitet, dass LIF aus dem Nährmedium entfernt wird und sie liefern funktionstüchtige Zellen in vivo.
Brüstle schreibt zu einem von ihm selbst untersuchten Anwendungsbeispiel:
"Die erfolgreiche Gewinnung humaner embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) hat faszinierende Perspektiven für die Transplantationsmedizin eröffnet.
Uneingeschränkte Vermehrbarkeit und die Fähigkeit, in alle somatischen Zelltypen ausreifen zu können, machen ES-Zellen zu einer nahezu unerschöpflichen Spenderquelle für verschiedenste Organsysteme. Besonders vielversprechend erscheinen ES-Zellen für den Zellersatz in Geweben mit geringem Regenerationspotenzial wie z.B. das Zentralnervensystem (ZNS).
Wissenschaftlicher Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe ist die in vitro Differenzierung von ES-Zellen in neurale Vorläuferzellen und deren Transplantation in Tiermodelle neurologischer Erkrankungen. Da die entwicklungssteuernden Signale für die Herstellung zahlreicher Subtypen von Nervenzellen noch nicht identifiziert sind, haben sich unsere ersten Bemühungen auf Erkrankungen mit Befall von Gliazellen konzentriert.
Wir haben Zellkulturprotokolle etabliert, die die Herstellung ES-Zellabgeleiteter glialer Vorläuferzellen in reiner Form erlauben. Sowohl in vitro als auch nach Transplantation ins Nervensystem von Empfängertieren haben diese Zellen die Fähigkeit, sowohl in Astrocyten als auch in Oligodendrocyten ausreifen zu können.
Um zu untersuchen, ob derartige Zellen für die Reparatur von Myelinkrankheiten eingesetzt werden können, haben wir sie in das Nervensystem von Myelin-defizienten Ratten implantiert. Hierbei handelt es sich um ein Tiermodell für die Pelizaeus-Merzbacher’sche Erkrankung, eine angeborene Myelinerkrankung, die bei den betroffenen Kindern zu schweren neurologischen Ausfällen führt. Ursache der Pelizaeus-Merzbacher’schen Erkrankung wie auch der Veränderungen bei
Myelin-defizienten Ratten sind Alterationen des Gens, das für das Proteolipidprotein (PLP) kodiert.
Die Transplantationsergebnisse an Myelin-defizienten Ratten waren außerordentlich erfolgversprechend. Bereits zwei Wochen nach Transplantation ins Rückenmark zeigte sich, dass die transplantierten Vorläufer nicht nur überleben, sondern in das Empfängergewebe einwandern, Nervenzellfortsätze mit fehlender Markscheidenbildung aufsuchen, sich an die Nervenzellfortsätze anlagern, zu Oligodendrocyten ausreifen und ein dichtes Netz von Markscheiden ausbilden. Unsere Studie verdeutlicht, dass ES-Zellabgeleitete neurale Vorläufer tatsächlich zur Reparatur eines spezifischen Defektes im zentralen Nervensystem eingesetzt werden können (Brüstle et al., 1999)."

Zusammenfassung der Merkmale von embryonalen Stammzellen

1. Sie stammen von der innerer Zellmasse oder dem Epiblasten ab.
2. Sie können sich beliebig oft symmetrisch teilen ohne sich zu differenzieren (long-term-self-renewal).
3. Aus ihnen können sich Zelltypen entwickeln, die sonst vom Ektoderm, Mesoderm oder Endoderm abstammen würden.
4. Sie können sich in einen sich entwickelnden Organismus integrieren, wodurch ein chimäres Tier gebildet würde, das Zellen mit dem eigenen Erbgut und Zellen mit dem eingeführten Erbgut aufweisen würde.
5. Sie können auch die Keimdrüsenleiste besiedeln und Keimzellen bilden.
6. Sie exprimieren Oct-4, wodurch die Teilungen und der undifferenzierte Zustand aufrecht erhalten werden.