Herstellung und Anwendung genetischer Fingerabdrücke

Einleitung:
Will man zwei oder mehr Individuen genetisch unterscheiden, so ist dafür ein genetischer Polymorphismus nötig, d.h. ein Teil der Population muss das Allel A besitzen, ein anderer Teil das Allel B. Ein bekannter Polymorphismus ist z.B. der Blutgruppen-Polymorphismus, der um die Jahrhundertwende von Landsteiner entdeckt und untersucht wurde. Er wurde dann schon bald in der Kriminalistik und zum Vaterschaftsnachweis eingesetzt. (Ein Allel ist eine bestimmte Variante eines Gens, jede Person besitzt z.B. in Bezug auf das Blutgruppensystem AB0 zwei Allele, wobei dann der Besitz von zwei Allelen A bedeutet, dass sie von der Blutgruppe A ist, besitzt sie die Allele A und B, dann ist sie Blutgruppe AB usw.). Eine Person mit der Blutgruppe A ist von einer mit B unterscheidbar. Sind dagegen beide Personen von der Blutgruppe A, so kann man sie genetisch nicht unterscheiden.
Ist der Anteil des einen Allels sehr gering wie z.B. bei Erbkrankheiten (z.B. Phenylketonurie), so ist das Gen für eine genetische Unterscheidung nicht geeignet, weil die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Personen die gleichen Allele besitzen sehr groß ist.
Beispiel: Möge ein Gen in der Form der Allele P und Q vorkommen. Wenn das Allel P mit der Häufigkeit 1% in der Bevölkerung vertreten ist, dann hat das Allel Q die Häufigkeit 99%. Dann ist die Wahrscheinlichkeit sehr klein, dass zwei beliebig herausgegriffene Personen unterschiedliche Anlagen in Bezug auf dieses Gen besitzen, denn in der Regel werden sie beide zwei Allele Q besitzen und sind dann nicht unterscheidbar. Kommen dagegen beide Allele mit der Häufigkeit 50% vor, dann ist die Wahrscheinlichkeit viel größer, dass zwei beliebige Personen auch unterschiedliche Anlagen besitzen und damit genetisch unterscheidbar werden.
Bzgl. des genetischen fingerprintings kann man drei verschiedene Methoden unterscheiden:
1. RFLPs (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus).
Diese Methode beruht auf der unterschiedlichen Länge von DNA-Fragmenten, die man beim Schneiden mit Restriktionsenzymen erhält und zwar, weil die Enzyme bei verschiedenen Personen an an zwei (eine Gruppe der Population) oder an drei Stellen (andere Gruppe der Population) der DNA schneiden. (s. auch Restriktionsenzyme).
2. VNTRPs (Variable-number-of-tandem-repeats-Polymorphismus)
Diese Methode beruht darauf, dass verschiedene Individuen einer Population an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Minisatelliten (ihre Länge beträgt 10-100 Nukleotide) besitzen (das bedeutet einfach, dass z.B. eine bestimmte Nukleotidfolge bei einer Person 15-mal, bei einer anderen 22-mal, bei einer dritten 25-mal wiederholt wird und dass dann dadurch alle drei Personen genetisch an dieser Stelle unterscheidbar sind. Die eingesetzten Restriktionsenzyme schneiden zwar bei verschiedenen Personen an denselben zwei Stellen die DNA, aber es liegen unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Sequenzen zwischen den Schnittstellen. Es liegt hier also ein anderer Grund für die unterschiedliche Länge der Restriktionsfragmente vor. (Beispiel s. bei STR) und
3. STRPs (Short-tandem-repeats-Polymorphismus)
Diese Methode beruht darauf, dass verschiedene Individuen einer Population an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Mikrosatelliten besitzen (d.h. dass das gleiche Prinzip wie bei den VNTRs benutzt wird, nur sind die repetitiven Sequenzen kürzer). Die Wiederholungen sind hier nur 2-7 bp lang. Dadurch ist die gesammte Sequenz in sich sehr ähnlich und bei Zellteilungen, kann es leicht zu einem Verrutschen der Stränge bei der Reduplikation der DNA kommen. (Beispiel: gatagatagatagata enthält 4-mal tandemartig die Sequzenz gata, dieser STR kann sich in einem Gen befinden, bei anderen Personen kann gata vielleicht 6-mal oder 8-mal usw. wiederholt werden). Dadurch sind mehr oder weniger alle Individuen einer Population bzgl. dieser Sequenzen heterozygot und untereinander verschieden. Daher eignen sie sich ausgezeichnet für die Unterscheidung beliebiger Individuen einer Population und sie werden deshalb bei kommerziellen Tests verwendet. D.h. dass im Vergleich zum Blutgruppenpolymorphismus man hier damit rechnen kann, dass verschiedene Personen auch genetisch verschieden sind, während bei jenem doch eine relativ große Wahrscheinlichkeit besteht, dass verschiedene Personen die gleiche Blutgruppe besitzen und damit nicht unterscheidbar sind.

Abb.1

Beispiel eines Mikrosatelliten. Hier wird im Erbgut die kurze Sequenz GT 18-mal wiederholt.

Damit man die verschiedenen oben genannten Verfahren versteht, nach denen genetische fingerprints hergestellt werden, ist es notwendig, die verschiedenen Arten von Polymorphismen zu verstehen. Daher erkläre ich diese erst einmal in den folgenden Abbildungen. Durch Anklicken der blau geschriebenen Links kann man sich noch nähere und ausführlichere Erklärungen zu den entsprechenden Teilen holen.

Zur Herstellung der verschieden langen Fragmente gibt es zwei Methoden. Die erste benutzt Restriktionsenzyme, die an nicht weit auseinanderliegenden Stellen der DNA jeweils diese schneidet. Liegt eine VNTR-Region dazwischen, dann sind die entstehenden Fragmente von unterschiedlicher Länge.
Die zweite Methode benutzt die PCR. Dabei wird die DNA nicht geschnitten, sondern nur von einer festgelegten Stelle vor der polymorphen DNA-Region bis zu einer anderen Stelle hinter dieser Region durch die PCR vielfach kopiert (man sagt auch amplifiziert), wodurch man eine große Menge dieser Kopien bekommt und sie so leichter nachweisen kann.

Die jetzt zunächst erklärten beiden Verfahren benutzen Restriktionsenzyme.

Zum Schneiden der DNA werden Restriktionsenzyme benutzt (s. dazu Abb.2). Es gibt drei Schnittstellen. Die äußeren Schnittstellen besitzen alle Induividuen der Population. Die mittlere Schnittstelle dagegen besitzt nur ein Teil der Population. Sie dient also zur Unterscheidung der untersuchten Personen. Durch solch eine Situation ist ein RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) charakterisiert. Nur wenn sich die Population in einem angemessenen Umfang in (mittlere) Schnittstellenbesitzer und Nichtbesitzer aufteilen lässt, ist die Schnittstelle zur Unterscheidung verschiedener Individuen geeignet. Der Text über Restriktionsenzyme erläutert, wie diese Enzyme die DNA schneiden und wie man sie dafür einsetzen kann, DNA-Fragmente zu sequenzieren. Man sollte auch wissen, was eine Gelelektrophorese und ein Southern-Blot ist, da diese Methoden dafür verwendet werden, die durch das Schneiden der DNA erhaltenen Fragmente zu trennen, zu markieren und zu erkennen. Southern-Blots sind aufwendig und werden benötigt, wenn nur kleine Mengen der DNA und damit der entstehenden Fragmente zur Verfügung stehen, andernfalls ist die Durchführung einer normalen Gelelektrophorese möglich.
Wie sich eine heterozygote Veranlagung bzgl. einer Schnittstelle auf das Ergebnis einer Gelelektrophorese auswirkt, erläutert die folgende Abbildung 2.

Abb. 2

Gelelektrophorese nach dem Schneiden mit dem Restriktionsenzym M

In b) sind Abschnitte der DNA dargestellt. Der DNA-Abschnitt A wird von M nur an zwei Stellen geschnitten, der DNA-Abschnitt B dagegen an drei Stellen. Dadurch erzeugt der Abschnitt A nur ein längeres DNA-Fragment beim Schneiden, der Abschnitt B dagegen zwei kürzere. Wir nehmen an, dass die mittlere Schnittstelle in der Population polymorph ist.
Nun wird eine radioaktive Sonde benutzt, um jeweils ein DNA-Fragment sichtbar zu machen. Die Sonde (schwarzer Balken) hybridisiert mit dem vom DNA-Fragment A erzeugten Band und mit dem kürzeren Fragment vom Abschnitt B.
Bei AA-Individuen ist deshalb ein dickes Band zu sehen, ebenso bei BB-Individuen. Dagegen sind die Bänder bei AB-Individuen dünner, weil jeweils nur die Hälfte der DNA-Fragmente hybridisiert wie in den beiden anderen Fällen.
Daraus geht hervor, dass alle drei Typen genetisch voneinander unterschieden werden können. Man kann durch die Analyse nachweisen, ob ein Individuum vom Typ AA, AB oder BB ist.

Man kann den Erbgang hier mit einem einfachen eingenigen mendelschem Erbgang vergleichen. Man spricht in diesem Falle von einem RFLP (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus), weil die entstehenden DNA-Fragmente von unterschiedlicher Länge sind oder auch von einem RSP (Restriktions-site-polymorphismus), weil er auf dem Schnitt des Enzyms an einer ganz bestimmten zusätzlichen Stelle (site) auf der DNA beruht. Es handelt sich hier um eine single-locus-Analyse (die Analyse erfolgt nur an einem Genort). Damit kann man natürlich nur wenige Individuen voneinander unterscheiden. D.h. ähnlich wie beim Blutgruppenpolymorphismus ist die Wahrscheinlichkeit noch groß, dass zwei beliebige Personen vom gleichen Typ sind und damit nicht unterscheidbar. Daher wird dieses Verfahren auch nicht angewendet, um fingerprints herzustellen, aber es wird schon das Prinzip deutlich. Die Unterscheidungsfähigkeit lässt sich dadurch steigern, dass man mehrere single-locus-Analysen zu einem multi-locus-Verfahren erweitert. Dann werden also mehrere Restriktionsenzyme, die jeweils eine unterschiedliche Schnittstelle aufweisen, gleichzeitig verwendet (und natürlich die entsprechenden Sonden zu jedem Enzym), so dass man mehrere unterschiedliche Banden erhalten kann, oder es wird ein Enzym verwendet, das mehrere unterschiedliche Schnittstellen im Genom aufweist. Dann braucht man natürlich trotzdem mehrere verschiedene Sonden, für jede Schnittstelle eine.

Andere Verfahren zur Herstellung genetischer fingerprints beruhen auf VNTR-Polymorphismen (Variable number of tandem repeats, die Länge der repeats variiert zwischen 9-80 bp). Dazu muss man etwas über die Genomstruktur wissen, nämlich was repetitive Sequenzen sind und wie man sie für fingerprints nutzen kann. Falls Sie darüber nichts wissen sollten, lesen Sie bitte den Text: Repetitive Sequenzen. Sehen Sie dazu auch die folgende Abbildung, an der man auch schon das Wesentliche verstehen kann.

Abb. 3 VNTR-Polymorphismus

In b) sind 6 verschiedene Chromosomen A-F dargestellt. Bei allen Chromosomen schneiden die Restriktionsenzyme HinfI (H1) und HaeIII (H3) an denselben Stellen auf dem Chromosom. Da aber unterschiedlich viele Tandemrepeats zwischen diesen Stellen liegen (bei A z.B. vier), entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente beim Schnitt. Das wird dann in der darüber dargestellten Gelelektrophorese deutlich. Der schwarze Kasten stellt den Bereich der DNA dar, an den die radioaktive Sonde bindet. Er muss natürlich zwischen den Schnittstellen liegen.
Das Chromosom E besitzt nur 3 Wiederholungen der repetitiven Sequenzen. Daher liefert es das kürzeste DNA-Fragment (s. über EF). Dagegen entsteht beim Schnitt von D das längste Fragment, da auf ihm 8 Wiederholungen liegen (s. über CD). Am linken Rand ist die Lösung dargestellt von welchem Chromosom welches Band kommt. Man erkennt, dass sich hier alle 6 Chromosomen klar unterscheiden lassen. Das bedeutet, dass man auch Individuen der Population, wenn sie zwei verschiedene Chromosomen besitzen, klar unterscheiden kann. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei verschiedene Personen das gleiche Bandenmuster besitzen, ist hier nur noch sehr gering (weshalb man es natürlich nicht völlig vernachlässigen darf). Wichtig wäre natürlich, wenn das Verfahren für kriminalistische Zwecke eingesetzt werden soll, genau zu wissen, wie groß in einer bestimmten Bevölkerung die Wahrscheinlichkeit noch ist, dass zwei Personen das gleiche Muster besitzen.

Dieses Verfahren ist dem oben dargestellten schon insofern überlegen, weil die Anzahl der Wiederholungen sehr unterschiedlich sein kann und weil es dadurch zu viel mehr unterschiedlichen Fragmenten kommt, wodurch die Wahrscheinlichkeit zwei Individuen unterscheiden zu können erheblich steigt.

Normalerweise steht für einen fingerprint nur wenig DNA zur Untersuchung zur Verfügung. Daher wird dann wie in den beiden obigen Beispielen ein Southern-Blot durchgeführt. Da dieser recht aufwändig ist, geht man heute eher dazu über die PCR (Polymerase Chain Reaction) zu nutzen, um die zur Verfügung stehende DNA vor der Analyse zu vervielfältigen. Dabei kann man dann auf die äußeren beiden Schnittstellen verzichten. Sie werden praktisch durch die Primer ersetzt, die festlegen dass von dieser bis zu jener Stelle die DNA amplifiziert wird. Erst danach wird die vervielfältigten Fragmente mit dem Restriktionsenzym an der dritten Stelle geschnitten. Dann kann eine normale Gelelektrophorese durchgeführt werden. Mit dem eigentlichen fingerprint hat die PCR aber nichts zu tun, sie dient lediglich dazu, die zur Verfügung stehende DNA zu vermehren. Sie bringt allerdings den Vorteil mit sich, dass die Länge der entstehenden Fragmente willkürlich festlegbar sind, weil sie davon abhängen, wo der erste Primer (vor der zu kopierenden Region) und der zweite Primer (hinter der zu kopierenden Region) für die PCR ansetzt. Man kann die Länge der Fragmente dann so wählen, dass sich die Fragmente verschiedener ausgewählter Loci nicht überschneiden (z.B. dass die Fragmente für Locus 1 200-300 bp lang werden, diejenigen für Lokus 2 aber 500-700 bp lang werden) und sie dadurch gelelektrophoretisch gut zu trennen sind. Bei diesem Verfahren kann also jede polymorphe Schittstelle einzeln dazu dienen, einen fingerprint herzustellen.
Eine RFLP-Analyse mit Hilfe der PCR wird in Abb. 4 erläutert.

Abb. 4  RFLP-Analyse mit Hilfe der PCR

Die Chromosomen A und B unterscheiden sich in der Schnittstelle T. Hier sind keine drei Schnittstellen nötig, weil man in der PCR mit Hilfe der Primer vor dem Schnitt einen bestimmten Abschnitt aus dem Genom amplifiziert (vervielfältigt). Dann liegt genügend Material für eine Gelelektrophorese vor. Dann werden die amplifizierten Fragmente geschnitten. Stammen die Fragmente von A-Chromosomen, so erfolgt kein Schnitt und die Fragmente bleiben so erhalten wie sie waren. Stammen sie von einem Chromosom B, so werden sie geschnitten und es entstehen zwei kleinere Fragmente.
AA-Individuen besitzen zwei A-Chromosomen, daher entsteht bei ihnen ein einfaches dickes Band in der Elektrophorese. Bei BB-Individuen werden alle Fragmente geschnitten, daher besitzen sie zwei Bänder, die weiter laufen, weil sie kleiner sind. AB-Individuen besitzen alle drei Bänder. Man kann hier also ebenfalls alle drei Genotypen unterscheiden.

Eine ganz ähnliche Analyse kann mit Hilfe der PCR auch bei jedem VNTRP durchgeführt werden ohne dass ein Schnitt durchgeführt werden muss, weil hier wegen des VNTRP die zwischen den Primern liegenden Abschnitte verschieden lang sind. Das wird an einem Beispiel in der Abb. 5 erläutert.

Abb. 5    VNTR-Analyse mit Hilfe der PCR

Im Chromosom A liegen nur zwei, im Chromosom B dagegen vier tandemartige Wiederholungen der repetitiven Sequenz vor. Daher liefert eine PCR vom Chromosom A ein kürzeres Fragment als vom Chromosom B. Auch hier lassen sich ohne Schnitt alle drei Genotypen unterscheiden.
Das Verfahren wird hier nur an einem Genlocus dargestellt. Bei diesem Verfahren können natürlich viele Genloci gleichzeitig untersucht werden, wenn man die entsprechenden Primer für die PCR verwendet. Je mehr Genloci verwendet werden, desto höher ist natürlich die Wahrscheinlichkeit, dass verschiedene Individuen auch unterschiedliche Muster besitzen.

Fingerprints mit Hilfe der STRPs werden im Prinzip genau so durchgeführt wie die, die auf VNTRPs beruhen. Man muss wie dort auch die sie flankierenden Sequenzen kennen, um Primer für die PCR herstellen zu können. Dann wird diese durchgeführt und anschließend eine Gelelektrophorese.

Vergleich der VNTR- mit der STR-Methode:
VNTR haben 9-80 bp, STR nur 2-5. Für forensische Analysen werden STRs mit 4 bp verwendet, weil sie mit größerer Genauigkeit durch die PCR amplifiziert werden können, es gibt hunderte von STR-Systemen und Dutzende, die genauer analysiert wurden. Außerdem sind STRs weit verbreitet, besitzen genügend Variabilität, um eine gute Unterscheidbarkeit der Individuuen zu gewährleisten.
STRs mit Tandemrepeats der Länge 4 werden am meisten benutzt, weil sie in der PCR am zuverlässigsten ohne Fehler kopiert werden
Sie sind viel kürzer als VNTRs und können daduch besser in der Gelelektrophores getrennt werden. Wegen der Kürze kann auch leichter schon zerfallene DNA verwendet werden. Es gibt hunderte von STR-Systemen, einige Dutzend sind gut erforscht, man findet sie auf jedem Chromosom.

Vorteile von STR- gegenüber VNTR-Analysen:
1. Die STR-Fragmente sind kürzer und können deshalb mit besserer Auflösung getrennt werden.
2. STRs können leichter bei schon zerfallener DNA eingesetzt werden.
3. Es reichen extrem kleine Mengen für seinen Einsatz aus.
4. Die potentielle Anzahl möglicher zu verwendender Loci ist sehr groß.
5. Die Durchführung ist sehr rasch und kann in 1-2 Tagen erfolgen.
6. Der Prozess ist weitgehend automatisierbar.

Abschließend sollen in den folgenden Abbildungen noch zwei Beispiele für Anwendungen gebracht werden.
 

Abb. 6 (links) Feststellung von Verwandtschaftsverhältnissen

In der linken Abb. sind RFLPs verwendet worden, um das Genom von Mutter, Vater und Kind zu untersuchen. Dabei wurden drei verschiedene single-locus-Sonden verwendet, rechts zwei. Man kann erkennen, dass die Banden des Kindes eine Kombination der Banden der beiden Eltern darstellen.

Abb. 7 (rechts) Vaterschaftsprüfung mit Hilfe eines fingerprints.

Die DNA der Mutter (M), des Kindes (K) und der von zwei zu testenden Männern, ob sie als Väter in Frage kommen (V1 und V2).
An den Stellen, die mit einem Pfeil markiert sind, erkennt man, dass V1 eine gemeinsame Bande mit dem Kind, aber nicht mit der Mutter hat, V2 dagegen nicht. Diese Stellen zeigen also deutlich die Vaterschaft von V1 und schließen V2 als Vater aus.

 

Abb. 9

Mikrosatelliten von links nach rechts:
Vater, Mutter, ihre vier Kinder.
Man sieht, dass alle 6 Personen individuell erkennbar sind, d.h. ihr eigenes Muster besitzen. Die Muster der Kinder sind Kombinationen aus den Banden beider Eltern.

Kontakt:: Kontakt: Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de
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