Herstellung und Bedeutung von Knock-out Mäusen

Bedeutung der Knock-out-Mäuse

Will man die Funktion eines Gens untersuchen, so sucht man nach Mutanten in diesem Gen. Diese werden dann mit normalen Tieren verglichen, die eine solche Mutation nicht besitzen. Es läßt sich aber nie ganz ausschließen, dass die Unterschiede wenigstens z.T. auch auf andere Gene zurückzuführen sind, in denen sich die Tiere ja zwangsläufig unterscheiden. Das Prinzip der isolierenden Variation konnte also dadurch in der Biologie nicht streng eingehalten werden.
Unter Knock-out-Mäusen versteht man nun solche Tiere, bei denen ein ganz bestimmtes Gen gezielt ausgeschaltet wurde, um dessen Wirkungen zu prüfen. Man möchte gern zwei Mäusestämme haben, die in sämtlichen Genen gleich sind und sich nur in dem Knock-out-Gen unterscheiden. Bei dem ersten Stamm ist es dann intakt, bei dem zweiten defekt. Dann müssen Unterschiede im Körperbau oder der Physiologie auf dieses Gen zurückgeführt werden. Daher benötigt man für dieses Experiment von vornherein einen Mäusestamm, bei dem alle Tiere den gleichen genetischen Hintergrund haben. Es werden deshalb Inzuchttiere verwendet. Diese Inzucht wird schon seit einigen hundert Generationen durchgeführt (konsequente Bruder-Schwester Verpaarung), was dazu führt, dass sich die Tiere genetisch gar nicht oder nur sehr geringfügig unterscheiden.
Weiter kommt hinzu, dass Mutanten eines Gens oft schwer zu finden und zu identifizieren sind. Während es bei Organismen wie Drosophila leicht ist z.B. durch Bestrahlung viele verschiedene Mutanten zu erzeugen und zu untersuchen, gelingt das bei Säugern wegen ihrer geringen Nachkommenzahl nicht. So ist man bei dieser Tiergruppe weitgehend auf den Zufall angewiesen, dass man eine bestimmte Mutation entdeckt. Sucht man z.B. nach Mäusen, die z.B. eine ähnliche Krankheit wie die cystische Fibrose haben, so tritt eine Mutation in dem Gen sehr selten auf und ist vielleicht auch nur schwer zu finden. Dadurch, dass man Mäuse gezielt in bestimmten Genen mutieren kann, kann man also sog. Krankheitsmodelle für bestimmte Krankheiten herstellen.

Herstellungsverfahren

Die Schritte, die zur Herstellung transgener Knock-out-Mäuse notwendig sind sollen hier nun zusammen gestellt werden und jeder Schritt soll näher erläutert werden.
1. Für die Erzeugung der Mutaten werden Stammzellen von Mäusen verwendet, weil man in einer erwachsenen Maus natürlich nicht sämtliche Körperzellen verändern kann. Solche Stammzellen werden aus Blastocysten entnommen (s. Stammzellen). Die entnommenen Stammzellen können durch Zugabe von Wachstumsfaktoren in vitro beliebig vermehrt werden und am Leben gehalten werden.

Abb.1 Darstellung der Integration der Fremd-DNA in ein ganz bestimmtes Gen

a: Das Gen, das verändert bzw. mutiert werden soll. E1 bis E5 sind Exons, dazwischen liegen Introns.
b: Die roten Pfeile zeigen, welche Stellen, der eingeführten DNA zum ursprünglichen Gen homolog sind. neo ist das Neomycinresistenzgen, HSVTk ist ein Abschnitt, der für eine Thymidinkinase codiert und mitintegriert wird, falls keine homologe Rekombination stattfindet. LxP sind Sequenzen, die hier nicht näher erläutert werden, die zum Herausschneiden des Neomycinresistenzgens dienen (Sie sind für das Verfahren nicht unbedingt nötig).
c: So sieht die DNA-Sequenz im Tier nach ihrer Veränderung aus. Das Gen kann nicht mehr abgelesen werden, weil die Neomycinsequenz zwischen den Exons liegt. (Es muss dafür gesorgt werden, dass das Gen wirklich nicht abgelesen wird, z.B. durch Einsetzen einer PolyA-Sequenz vor dem Neomycingen. Das Neomycingen benötigt einen eigenen starken Promoter, damit sichergestellt ist, dass es auch abgelesen wird.).
d: Mit der Cre-Rekombinase kann das Neomycingen herausgeschnitten werden. Das verbleibende Gen ist defekt, weil ihm Exon 2 fehlt.

2. Diese Stammzellen werden nun genetisch verändert und zwar durch sog. homologe Rekombination. Das ist ein Verfahren, durch das an einer gezielt ausgesuchten Stelle im Erbgut eine beliebige andere Sequenz eingesetzt werden kann. Man kann also z.B. das Insulingen ausschalten, indem man in dieses Gen eine völlig andere Sequenz von Nukleotiden einsetzt, wodurch kein funktionstüchtiges Insulin mehr gebildet werden kann. Eingesetzt wird die Sequenz dadurch, dass man sie künstlich herstellt und dann über Elektroporation (durch elektrischen Strom wird die Membran so durchlässig gemacht, dass die künstlichen DNA-Moleküle eindringen können) in die Stammzelle einführt. Die Integration in das Erbgut nimmt die Zelle dann selber vor. Allerdings kann die Sequenz einerseits an der richtigen Stelle eingesetzt werden, andererseits aber auch an einer nicht erwünschten Stelle oder sogar mehrfach, was man auch nicht möchte. Um das auszuschließen, verleiht man der eingesetzten Sequenz drei wichtige Eigenschaften (s. dazu Abb). Sie enthält einen Marker (meist das Neomycinresistenzgen), der dazu dient, die Zellen später positiv herausfinden zu können (bei Zugabe von Neomycin sterben alle Zellen, die die Sequenz nicht integriert haben ab), die das veränderte Erbgut besitzen. Um den Marker herum liegen auf jeder Seite zum intakten Gen homologe Sequenzen, die dafür sorgen sollen, dass hier eine Hybridisierung mit dem Erbmaterial stattfindet und die Sequenz somit an der richtigen Stelle im Erbgut eingesetzt werden kann. Am Ende ist dann ein zweiter Marker für eine negative Selektion eingesetzt. Dieser wird bei einer homologen Rekombination nicht mit in das Erbgut integriert, wohl aber, wenn die Sequenz an einer beliebigen anderen Stelle in das Erbgut integriert wird. Dieser Marker dient also dazu die Zellen bei denen eine homologe Rekombination aufgetreten ist von solchen zu unterscheiden bei denen eine zufällige Integration aufgetreten ist (oder mehrfache Integrationen erfolgt sind). Die Zellen, wo die Sequenz sich an einer falschen Stelle integriert hat, werden nun abgetötet. Damit verbleiben nur noch Stammzellen, die an der gewünschten Stelle des Erbguts mutiert sind.

3. Die genetisch veränderte Stammzelle wird nun in eine andere Blastocyste eingeführt, die wiederum einer scheinschwangeren Maus implantiert wird, die dann das heranwachsende Tier austrägt. Aus dieser implantierten Blastocyste entsteht also ein chimäres Tier wie man sagt, ein Tier, dessen Körperzellen nicht alle dasselbe Erbgut enthalten, sondern das einerseits Zellen mit dem ursprünglichen Erbgut enthält und andererseits solche mit dem Erbgut der eingesetzten Stammzelle (der Körper ist also mosaikartig aus zwei verschiedenen Erbguttypen aufgebaut).
Man kann nun feststellen, dass die eingesetzte Stammzelle zu allen Geweben der heranwachsenden Maus beiträgt. Das bedeutet, dass die Maus auch Ei- oder Samenzellen mit dem veränderten Erbgut besitzt.

4. Das chimäre Tier wird nun mit einem normalen Tier gekreuzt. Die Nachkommen sind meist homozygot (gesund), aber einige von ihnen tragen das veränderte Gen, weil die Ei- oder Samenzelle von der eingesetzten Stammzelle abstammt. Sie sind heterozygot. Diese heterozygoten Tiere müssen nun herausgefunden werden, was durch Untersuchungen des Erbgutes geschieht. Von solchen heterozygoten Tieren braucht man nun ein Weibchen und ein Männchen. Diese werden miteinander gekreuzt. 25% der Nachkommen dieses Paars müssen homozygot krank sein. Damit ist das gesteckte Ziel erreicht.

Anwendungen und Beispiele

Bei der Untersuchung der Entwicklung wurden durch diese Methode große Fortschritte erreicht. Z.B. sind die Gene Myf5 und MyoD für die Entwicklung der Muskulatur notwendig. Es hat sich dann herausgestellt, dass ein Knock-out in beiden Genen notwendig ist, damit sich keine Muskulatur entwickelt. Daraus schließt man, dass diese Gene sich teilweise ersetzen können, also redundante Wirkungen ausüben.
Für die Untersuchung der cystischen Fibrose wurde ein "Mausmodell" hergestellt, das die gleiche Mutation trägt, wie 70% der Patienten, was zu großen Fortschritten in der Behandlung geführt hat.
Mäuse, deren p53-Gen mutiert ist, bekommen Krebs. Sie sind ein sehr nützliches Modell für die Krebsforschung. Es ergab sich dann dass 50% aller Krebspatienten eine Mutation in diesem Gen besitzen, woraus die enorme Bedeutung dieses Gens für die Entstehung eines Krebses hervorgeht.

Ich danke Herrn Euwens (Uni Bonn) dafür, dass er mich auf die Wichtigkeit der Verwendung von Inzuchtstämmen hingewiesen hat und dass es nicht selbstverständlich ist, dass das Gen nach homologer Rekombination nicht abgelesen wird.

Adresse: Helmut Hupfeld, Katzenberg 11, 27283 Verden, Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de
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