Restriktionsenzyme
Schneiden, Trennen, Verbinden, Sequenzieren von DNA und Kartieren des Genoms

Erst in den 70er Jahren wurden die Werkzeuge entwickelt, die die moderne Gentechnologie ermöglichten. Dazu gehören zunächst einmal die Entdeckung und Nutzbarmachung der Restriktionsendonukleasen (kurz Restriktionsenzyme, s. Linder S.327) und der Ligasen. Die Restriktionsenzyme wurden entdeckt, als man untersuchte, wie sich Bakterien gegen Viren schützen. Sie zerschneiden die eindringende DNA der Viren. Ihre eigene DNA ist durch Methylierung an entsprechenden Stellen der DNA geschützt. Dafür besitzen die Bakterien ein entsprechendes Modifikationsenzym, das DNA an den Stellen methyliert, an denen das eigene Restriktionsenzym die DNA schneiden würde. Mit den Restriktionsenzymen lassen sich DNA-Stücke gezielt an bestimmten Stellen spalten. Ligasen sind Enzyme, die die zerschnittene DNA wieder zusammenfügen können.

Abb.1 Beispiele für Restriktionsenzyme: Hpa I stammt von Haemophilus parainfluenza. Es schneidet die 6 bp lange palindromische DNA-Sequenz in der Mitte glatt durch. Eco RI stammt von Escherichia coli dem berühmten Darmbakterium und schneidet eine 6 bp lange DNA-Sequenz überlappend durch, wobei klebrige Enden entstehen. Klebrig heißt hier, dass komplementäre Sequenzen mit dem herausragenden Ende hybridisieren können (s. nächste Abb). Hier wäre das also die Sequenz -TTAA oder -AATT. Hind III stammt von Haemophilus influenza und schneidet eine 6 bp lange DNA-Sequenz überlappend durch. Pst I stammt von Providencia stuartii und schneidet ebenfalls überlappend.

Abb. 2 Nutzung der klebrigen Enden: Zwei DNA-Sequenzen wurden beide mit Eco RI geschnitten, wodurch die gezeigten überhängenden Enden entstanden. Sie passen genau zueinander. Der Spalt, der nach dem Verbinden (annealing) entstanden ist, kann durch Ligasen geschlossen werden.

Mit Hilfe der Restriktionsenzyme kann nun eine Kartierung des Genoms durchgeführt werden. Trennt man zunächst die einzelnen Chromosomen voneinander ab und nimmt man dann z.B. das Chromosom 1 des Menschen, so wird es durch ein bestimmtes Restriktionsenzym in eine genau definierte Anzahl von Fragmenten zerlegt und zwar in reproduzierbar dieselben. Das ist wichtig für die Gewinnung derselben Ausgangssituation. Jedes einzelne Fragment kann nun seinerseits mit anderen Restriktionsenzymen geschnitten werden, bis man so kleine Fragmente erhalten hat, die einer Sequenz-Analyse (Sanger-Methode (s.u.)) unterworfen werden können. Die Schritte, die man dazu durchführen muss, sollen nun im Einzelnen besprochen werden.
Wir gehen also von einem Chromosom oder einer recht langen DNA-Sequenz aus. Diese wird mit einem bestimmten Restriktionsenzym behandelt. Dadurch entstehen eine ganz bestimmte Anzahl von kleineren DNA-Fragmenten, die ihrerseits von unterschiedlicher Länge sind. Diese müssen also erst einmal getrennt werden. Das geschieht durch eine Gelelektrophorese.

Abb. 3 Gelelektrophorese-Methoden zur Trennung von DNA-Fragmenten. A: Beispiel für die Verwendung eines kleinporigen Polyacrylamidgels zur Trennung von DNA-Fragmenten von der Größe zwischen 50 und 200 Nukleotiden. Es sind 4 Bahnen zu erkennen. Die Mischung aller Fragmente wurde oben aufgetragen. Zwischen dem oberen und unteren Punkt ist eine elektrische Spannung angelegt. Weil die DNA-Fragmente geladen sind, wandern sie nun von oben nach unten. Die kürzeren Fragmente wandern, weil sie leichter sind, schneller. Dadurch sind die kurzen Fragmente unten zu finden (s. Markierung 50 = 50 Nukleotid-Sequenzen). B: Verwendung eines Agarosegels mittlerer Porengröße zur Trennung doppelsträngiger DNA mit einer Länge zwischen 1000 und 6000 bp. C: Pulsfeld-Agarosegel-Elektrophorese zur Trennung von Chromosomen.

Für die Sequenzierung kürzerer DNA-Fragmente (200-500 bp) gibt es heutzutage Automaten, die nach der Sanger-Methode arbeiten und die Sequenzierung automatisch erledigen können (s. Linder S.329). Die Methode soll hier deshalb nicht weiter erörtert werden. Es soll uns hier beschäftigen wie sie zur Kartierung eines Chromosomenabschnittes eingesetzt wird.
Angenommen wir haben ein bestimmtes DNA-Fragment von der Länge 10 kb isoliert und wollen es sequenzieren. Dann muss es erst einmal in kleinere Fragmente zerlegt werden, weil ein so langes Fragment nicht auf einmal sequenziert werden kann. Dazu wird es mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten und zusätzlich einzeln mit nur jeweils einem dieser Restriktionsenzyme. Danach wird eine Gelelektrophorese mit den entstandenen Fragmenten durchgeführt. Dadurch kann unter Umständen die Reihenfolge festgestellt werden, wie die Fragmente zusammen hängen. Das erläutert folgende Abb:

Abb. 4 Restriktionskartierung Durch das Schneiden des Ausgangsfragmentes mit zwei Restriktionsenzymen kann die Lage der Schnittstellen festgestellt werden. Auf diese Weise lassen sich vom gesamten Erbgut so genannte Restriktionskarten aufstellen.

Abb. 5 Restriktionskarten Ausschnitte von einem Abschnitt der DNA, der um das Hämoglobingen herum liegt. Die roten Quadrate entsprechen der a-Kette des Hämoglobins. Jeder Buchstabe gibt die Schnittstelle eines anderen Restriktionsenzyms an. Der Schimpanse besitzt die ähnlichste Karte im Vergleich zum Menschen.