Southern und Northern-Blotting

Southern-Blotting wird dazu verwendet, um in einem Gemisch von DNA- Fragmenten das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz nachzuweisen. Entsprechendes gilt für das Northern-Blotting für RNA-Sequenzen.
Beispiele für Fragestellungen, die mit dem Southern-Blot untersucht worden sind:
1. Wieviele Kopien von bestimmten Genen, z.B. Hämoglobingenen, gibt es im Erbgut ?
2. Gibt es homologe Gene zu einem Gen im selben Genom ? (Man denke an Genfamilien wie z.B. die Globingene, zu denen auch das Myoglobin-gen gehört).
3. Gibt es in Organismus B homologe Gene zu einem fraglichen Gen in Organismus A ? Über diese Fragestellung hat man z.B. ganz wichtige Gene, die bei der Entwicklung von Organismen eine Rolle spielen gefunden z.B. die Hox-Gene.
4. Kommt ein bestimmtes Exon in verschiedenen Genen vor ?

Für den Northern-Blot gibt es analoge Fragestellungen, die sich dann aber normalerweise auf mRNA beziehen. z.B.
1. In welchen Zellen wird ein bestimmtes Protein exprimiert ? Man sucht nach der entsprechenden mRNA.
2. Angenommen man kennt ein bestimmtes Gen und will wissen, ob es in verschiedenen Geweben oder zu verschiedenen Zeitpunkten in der Entwicklung des Tieres aktiv ist, so extrahiert man die mRNA aus dem Gewebe oder zum fraglichen Zeitpunkt und führt mit der bekannten Gensonde ein Northern Blot Verfahren durch.
Der Southern-Blot wird dann angewandt, wenn man nur wenig DNA zur Verfügung hat. Ist die Menge der zur Verfügung stehenden DNA groß genug, so läßt sich dieselbe Fragestellung auch durch eine einfacher durchzuführende Gelelektrophorese beantworten. Die einzelnen Schritte beim Southern-Blot sind dann:
1. Die zu prüfende DNA wird mit Restriktionsenzymen geschnitten.
2. Die DNA Fragmente werden einer Gelelektrophorese unterzogen, um sie voneinander zu trennen (s. Abb.1 - 1. Schritt).
3. Die DNA Fragmente werden mit Hilfe von Filterpapier auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und dort fixiert. Dieser Schritt ist notwendig, weil nur geringe Mengen von den DNA Fragmenten vorhanden sind (2. Schritt in der Abb.1).
4. Die Membran wird mit der radioaktiven Sonde inkubiert, so dass diese an der gesuchten DNA hybridisieren kann.
5. Es wird eine Autoradiographie durchgeführt.
(Es liegt eine Exe-Anmimation vor, die das Verfahren schrittweise simuliert, erläutert und die Anwendung zur Herstellung eines Fingerprints in einem Vergewaltigungsverfahren erklärt).

Abb.1 Ablauf des Southern Blots Die zu untersuchenden DNA-Stücke werden durch eine Elektrophorese getrennt. Daneben laufen radioaktiv markierte Stücke, deren Länge man kennt, um sich daran orientieren zu können. Im nächsten Schritt werden diese Fragmente auf einem Nitrocellulosepapier fixiert. Das geschieht dadurch, dass sie durch Löschpapier nach oben gesaugt werden. Das Nitrocellulosepapier wird abgenommen und es wird die radioaktive Sonde zugesetzt, um sie an der gesuchten DNA hybridisieren zu lassen. Danach werden die ungebundenen Sondenfragmente durch Waschen entfernt. Vom übrig bleibenden Papier wird nun eine Autoradiographie durchgeführt. Falls es zu Hybridisierungen gekommen ist, entstehen Bänder, wie sie in der Abb. eingetragen sind. Die Abb. stammt aus Alberts, Molekularbiologie der Zelle, VCH, 1997

Eine bestimmte Maus produziert zu viel Albumin im Blutserum. Es soll nun herausgefunden werden, woran das liegt. Als Vorwissen setzen wir gar nichts voraus, d.h. wir wissen nichts über Albumin (außer, dass es sich um ein Protein handelt) und auch nicht über das zugehörige Strukturgen.
Wenn wir an das Albumingen gelangen wollen, benötigen wir eine radioaktive DNA-Sonde, die eine teilweise gleiche DNA Sequenz aufweist, wie das Gen selbst. Um eine solche zu gewinnen, brauchen wir Informationen über die Aminosäuresequenz des Proteins oder die zugehörige m-RNA zur Herstellung des Proteins. Daher müssen wir eine dieser Informationen zuerst gewinnen.
Zur Ermittlung der Aminosäuresequenz von Albumin braucht man das Eiweiß selbst in gereinigter Form. Es könnte aus großen Mengen Lebergewebe gewonnen werden und dann sequenziert werden. Die dann bekannte Aminosäuresequenz würde es erlauben, Rückschlüsse auf die Nukleotidsequenz der m-RNA zu ziehen und eine künstliche radioaktive Sonde herzustellen.
Auf dem anderen Weg würde man alle mRNA-Arten aus Leberzellen trennen, reinigen und in vitro oder einem geeigneten System prüfen, welche von ihnen für die Herstellung von Albumin codiert. Dann wird sie sequenziert und ebenfalls eine radioaktive DNA-Sonde auf chemischem Wege hergestellt.
Das erstere Verfahren ist heute in Bezug auf die meisten Proteine wesentlich aufwendiger, weshalb in der Regel nach letzterem Verfahren vorgegangen wird.
Nun erfolgt das Northern Blotting.
Es werden also zunächst aus der mutierten und der normalen Maus gereinigte m-RNA aus Lebergewebe gewonnen. Diese m-RNAs werden einer Gelelektrophorese unterworfen und man erhält ein entsprechendes Bandenmuster. Dieses Bandenmuster wird auf Nitrozellulosepapier übertragen und dort fixiert = geblottet. Dann wird es in eine Lösung gegeben, die die radioaktive Sonde enthält. Diese hybridisiert mit der gesuchten m-RNA. Durch ihre Strahlung läßt sie sich durch eine Autoradiographie lokalisieren.
Die m-RNA von der mutierten Maus kann nun mit der m-RNA der normalen Maus verglichen werden. Falls sich hier keine wesentlichen Unterschiede herausfinden lassen, muss man daran gehen das Gen von Albumin aufzustöbern (dazu würde man ein Southern-Blotting durchführen, wobei man die schon gewonnene Sonde verwenden kann) und zu untersuchen.
Das Verfahren läuft prinzipiell ganz ähnlich. Damit man aber auch von kleinen DNA-Stückchen ausgehen kann, muss zunächst die gesamte DNA der mutierten und der normalen Maus mit Restriktionsenzymen in kleine Stücke zerlegt werden. Diese werden dann in Einzelstränge getrennt und dann einer Gelelektrophorese unterworfen und geblottet und das Gen wird mit der Sonde ermittelt.
Falls man dann die gesamte Nukleotidsequenz des Gens haben möchte muss das gefundene Gen vervielfältigt werden, damit es sequenziert werden kann. Dazu kann man entweder eine cDNA von der m-RNA herstellen oder man wendet die PCR auf das gefundene Gen an. Letzteres ist auf jeden Fall erforderlich, wenn man auch die regulativen Sequenzen des Gens finden und untersuchen will, weil diese in der m-RNA nicht enthalten sind.

Adresse: Helmut Hupfeld, Katzenberg 11, 27283 Verden, Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de
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