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Vereinfacht ausgedrückt werden Substitutionsmatrizen folgendermaßen berechnet:
Für jeden möglichen Austausch von Aminosäure i zu Aminosäure j wird festgestellt, mit welcher Frequenz (qij) dieser in einer Population von Alignments vorkommt. Dann wird ermittelt, mit welcher Frequenz die beiden Aminosäuren rein zufällig aufträten (pi * pj), auf der Basis der allgemeinen Häufigkeit der Aminosäuren in den Proteinen. Von dem Verhältnis wird der natürliche Logarithmus gebildet.
