Kapitel 34: Neurogenetik

34.1.2 "Reverse genetics": vom Protein zum Phänotyp

In manchen Fällen ist zunächst keine Mutation in einem im Nervensystem exprimierten Gen bekannt, und es gilt, ausgehend von den molekularen Daten, den Funktionszusammenhang aufzufinden, in dem sich das Gen befindet. Dann steht die Suche nach Mutanten und deren Charakterisierung am Ende der Analyse. Gerade für die genetische Analyse von Wirbeltieren ergibt sich oft das Problem der Redundanz: Während der Evolution sind durch Duplikationen, Transposition oder Polyploidisierung multiple Kopien einzelner Gene entstanden, die mit den Mitteln der klassischen Genetik nicht alle gleichzeitig mutagenisiert werden können. Die durch die Existenz von Genfamilien verursachte Redundanz eines Regelkreises macht diesen für die Analyse mit Defektallelen nur schwer zugänglich. In solchen Fällen sind sogenannte "gain-of-function"-Mutationen mit einem dominanten Phänotyp viel instruktiver. Oftmals kommen solche Mutationen durch ein verändertes (ektopisches) Expressionsmuster zustande.

Neue molekulargenetische Arbeitsmethoden erlauben es heute, zumindest in einer Reihe von Modellsystemen, beliebige Transkriptionseinheiten unter der Kontrolle eines heterologen Promotor-Enhancer-Ensembles zu exprimieren. Bei Drosophila geschieht dies mit dem pUAST/GAL4-System (s. Box 34-1). Auf diese Weise können heterologe Moleküle auf ihre Funktionalität geprüft werden, oder es können neue dominante Phänotypen durch ektopische Expression eines wildtypischen oder in vitro modifizierten Moleküls erzeugt werden. Der oft mißverstandene und abgenutzte Begriff des genetic Engineering erreicht mit dieser Technologie am ehesten seine Definition: Modellorganismen können zur Teststrecke für Mosaike von interagierenden Molekülen umkonstruiert werden. Damit verläßt die Molekularbiologie das klassische Reagenzglas und kann sich nunmehr im Umfeld des lebenden Organismus bewähren.

Box 34-1: Gesteuerte Fehlexpression von Genen mit dem pUAST/GAL4-System

Viele Genprodukte haben multifunktionelle Aufgaben während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus. Diese lassen sich nicht allein aufgrund eines phänotypischen Spektrums oder der zellulären Lokalisation voraussagen. Umgekehrt können Gene auch ein breites Expressionsmuster aufweisen, während ihre biologische Aktivität auf Teilbezirke eines Gewebes oder einen kurzen Zeitraum während der Morphogenese beschränkt bleibt. Die detaillierte Analyse der Funktionen kann auf sehr elegante Weise durch spezifische ektopische Expression oder Expression unter kontrollierten Bedingungen mit dem sogenannten pUAST/GAL4-System bei Drosophila melanogaster erfolgen, das von Andrea Brand und Norbert Perrimon entwickelt wurde.

Das pUAST/GAL4-System bedient sich der Tatsache, daß Genaktivität in einem heterologen Expressionssystem gesteuert werden kann, sofern auch die entsprechenden Transkriptionsfaktoren in der Zelle vorhanden sind. So ist es möglich, die Transkription eines beliebigen Gens in einer eukaryotischen Zelle unter der Kontrolle eines Enhancer-Elementes der Hefe S. cerevisiae zu exprimieren, wenn gleichzeitig der entsprechende Transkriptionsaktivator vorhanden ist.

Durch P-Element induzierte Keimbahntransformation ist es auf relativ einfache Weise möglich, Fliegenstämme zu erzeugen, die den Hefe-Transkriptionsfaktor GAL4 unter der Kontrolle eines einfachen Promotors auf einem Chromosom mit sich tragen. Da die Transposition solcher mobiler Elemente mehr oder weniger stochastisch erfolgt, finden sich unter den transformierten Stämmen zahlreiche Insertionen, deren gewebe- oder zeitspezifische Expression durch die räumliche Nähe eines distalen Promotorelementes oder "Enhancers" nachhaltig beinflußt wird. Durch nachträgliches "mobilisieren" der Transposons können zahllose Transformanten mit hochgradig zeitlich und räumlich spezifischer Expression von GAL4 erzeugt werden.

Das zu untersuchende Gen wird nun unter die Kontrolle des GAL4-Aktivators gebracht, indem es mit mehreren Kopien seines komplementären distalen Enhancer-Elements UAS (upstream activating sequence) aus Hefe und dem einfachen Hitzeschock-Promotor hsp70 aus Drosophila fusioniert wird. Ebenso wie GAL4 wird dieses Konstrukt mit Hilfe des P-Transposons in die Keimbahn von Taufliegen eingebracht. Die so erzeugten Stämme sind noch nicht in der Lage, das hybride Gen zu exprimieren, denn ihnen fehlt der notwendige heterologe Aktivator GAL4. Erst wenn die beiden separat erzeugten Stämme miteinander gekreuzt werden, kommt es in vorher bestimmten Geweben zum Zusammentreffen von GAL4 mit seiner Erkennungssequenz UAS, und damit zur Aktivierung der RNA-Polymerase II (Abb. 34-2). Damit kann eine Zielsequenz in zahlreichen Geweben und zu beliebigen Zeiträumen ektopisch exprimiert werden. Die Limitierung des Systems besteht lediglich in der Zahl und Spezifität der zur Verfügung stehenden GAL4-Insertionslinien. Bisher sind mehrere Hundert solcher Linien erzeugt und beschrieben worden, ihr Expressionsmuster reicht von wenigen Neuronen bis zu allgemeinen Ektodermabkömmlingen.

Mit dem pUAST/GAL4-System ist es zum Beispiel möglich, dominant negative Effekte eines Genproduktes zu studieren, dessen Expression normalerweise auf kleine Gewebebezirke oder einen kurzen Zeitraum während der Entwicklung beschränkt ist. Im Rahmen der Neurobiologie wurde dieses System zum Beispiel eindrucksvoll eingesetzt, um ektopische Augen durch Expression von Pax-6 zu erzeugen, und damit nicht nur die funktionelle Bedeutung des Gens für die Organogenese zu demonstrieren, sondern auch die funktionelle Homologie des verwandten aniridia-Gens aus Mäusen und einer verwandten Sequenz aus Tintenfischen zu zeigen (s. 34.3.2.3). Ähnliche Anwendungen erfuhr das System beim Nachweis der axonalen Wegfindung durch identifizierte Membranproteine.

Durch sein Potential, Genprodukte mit neuen zeitlichen und räumlichen Spezifitäten zu exprimieren, kommt das pUAST/GAL4-System einer Simulation von hypothetischen Evolutionsprozessen sehr nahe, die Veränderungen des Bauplanes durch neue Expressionsmuster zur Grundlage haben.

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