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Die Werte, die jedem möglichen Aminosäureaustausch zugewiesen wurden, werden in einer sogenannten Austausch- oder Substitutionsmatrix gespeichert. Leider ist es nicht möglich, eine Austauschmatrix einfach anhand der physikochemischen Eigenschaften der Aminosäuren zu errechnen.
Austauschmatrizen werden empirisch aus Sequenzvergleichen gewonnen. Dabei wird ausgewertet, welche Aminosäureaustausche sich zwischen zwei verwandten Sequenzen ereignet haben. Die Frequenz der tatsächlich vorkommenden Austausche wird in Relation zu der Frequenz gesetzt, die erwartet würde, wenn die Austausche rein zufällig stattgefunden hätten.
Die Mutationen treten natürlich zufällig auf. Die Sequenzen, die wir untersuchen können, sind jedoch das Resultat der Selektion, die während der getrennten Entwicklung von zwei Sequenzen gewirkt hat. Wir sehen nur die Austausche, die sich bewährt haben oder sich nicht zu negativ auswirkten.