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Die BLOSUM-Substitutionsmatrizen (BLOSUM = BLOcks SUbstitution Matrix) wurden ähnlich wie die PAM-Matrizen kalkuliert (Henikoff & Henikoff, 1992). Allerdings wurden dazu nicht eng-verwandte Sequenzen betrachtet und die Ergebnisse auf evolutionär größere Distanzen extrapoliert, sondern es wurden konservierte Proteindomänen (blocks) von evolutionär weit-entfernten Proteinen miteinander verglichen.
Die Zahlen der BLOSUM-Reihe geben an, welche maximale Identität die Sequenzen haben, mit denen die Substitutionsmatrix errechnet wurde. Deshalb sollte BLOSUM45 für sehr divergente Sequenzen, BLOSUM80 für sehr eng-verwandte Sequenzen eingesetzt werden. In den meisten Fällen wird die BLOSUM62-Matrix als Voreinstellung in den BLAST-Programmen verwendet.