Homeotische
Mutationen: Darwin hatte 1859 sein Werk "Die Entstehung
der Arten" publiziert. Damals war über Genetik praktisch
nichts bekannt. (Mendel veröffentlichte seine Untersuchungen
1865 in einer wenig bekannten Zeitschrift und seine Ergebnisse blieben
bis zur Wiederentdeckung 1905 durch Correns und Czermak praktisch
unbekannt). Man hatte keine oder falsche Vorstellungen von der
Vererbung. Daher konnte Darwin auch nicht erklären, wie
genetische Variation zustande kommt. Das war ein ganz zentrales Manko
seiner Theorie zu dieser Zeit. Um der Lösung dieser Frage
näher zu kommen, beschäftigte sich William Bateson
mit der phänotypischen Variation der Tiere und versuchte sie
zu klassifizieren. Er berichtete davon in seinem Werk: Materials for
the study of variation, Mc Millan 1894, London. Er führte den
Begriff Homeosis für eine Klasse ganz besonderer Mutationen
ein. Beispiele dafür führt Bateson von Insekten an
(s. Abb. 1), bei denen z.B. displazierte
Körperanhänge auftreten (z.B. wenn statt der Antenne
ein Bein oder statt eines Beines ein Flügel ausgebildet wurde,
bei Wirbeltieren gab es Fälle, dass z.B. statt eines
Halswirbels ein Brustwirbel gebildet worden war, der eine
zusätzliche Rippe aufwies u.ä.
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Abb.1 Homeotische Mutationen
A: Der äußere Teil einer Antenne eines Insektes ist beinartig (s. Pfeil). D.h. ein vorderer Körperteil ist durch einen weiter hinten liegenden Körperteil ersetzt. B: Der Schmetterling weist 5 Flügel auf, ihm fehlt rechts hinten ein Bein, was hier nicht zu sehen ist. Ein ventraler Teil des Körpers ist also in einen dorsal liegenden verwandelt worden. C: Ein Auge des Krebses ist durch eine Antenne ersetzt (s. Pfeil). |
Postulierung
homeotischer Gene: Nach der Wiederentdeckung der
Mendelschen Vererbungsregeln erkannte Bateson sofort ihre
große Bedeutung und interpretierte seine oben beschriebenen
Phänotypveränderungen als homeotische Mutationen. So
interpretierte er eine bestimmte Art der Kurzfingerigkeit nicht als
Verkürzung der einzelnen Finger, sondern als Ausbildung
mehrerer Daumen. Entsprechende Erklärungen gab er für
die Ausbildung von Blütenblättern anstelle von
Staubblättern bei Pflanzen ab usw.
Der definitive Beweis dafür, dass es solche Gene
tatsächlich gibt, gelang dann Bridges in Morgans Laboratorium,
in dem man begonnen hatte Drosophila intensiv zu untersuchen. Er fand
unter den Mutanten ein Tier, bei dem die Halteren durch ein zweites
Flügelpaar ersetzt waren. D.h. das 3. Thoraxsegment T3 war in
das 2. Thoraxsegment T2 transformiert worden. Er konnte nachweisen,
dass nur ein Gen mutiert war. Diese Mutation wurde fortan als bithorax
(bx) bezeichnet und die Mutanten wurden als Stamm weiterhin gehalten.
Der
Bithorax-Komplex: Die bithorax-Mutation bx war
Ausgangspunkt für die genetische Untersuchung des
bithorax-Komplexes (BX-C) durch Edward Lewis. 1978
veröffentlichte er zusammenfassend seine Ergebnisse dazu.
Dieser Komplex besteht aus mehreren Genen, die nebeneinander liegen. Da
sie in ihrer Sequenz große Ähnlichkeiten besitzen,
glaubte Lewis, dass sie durch Duplikationen (Verdopplungen) entstanden
sind und anschließend durch Mutationen sich auseinander
entwickelt haben. Fehlte der gesamte Komplex (Deletion), so entstanden
letale Mutanten, die sich jedoch im Larvenstadium so weit entwickelten,
dass man erkennen konnte, das alle hinter T2 liegenden Segmente fehlten
(s. Abbildung 2).
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Abb.
2 Auswirkungen einer Deletion, bei der
der bithorax-Komplex (BX-C) fehlt.
a: Hier ist der Wildtyp der Larve von Drosophila dargestellt. Aus T1 bis T3 gehen die drei Thoraxsegmente des erwachsenen Tieres hervor. Aus A1 bis A8 werden die verschiedenen Abdominalsegmente gebildet. Sie sind bei der Larve durch ein ganz typisches Dentikelmuster charakterisiert (die weißen Pünktchen). b: Fehlt dem Tier der bithorax-Komplex im Erbgut, so fehlen der Larve sämtliche Abdominalsegmente sowie T3. Die Larve kann sich nicht zu einem lebenden erwachsenen Tier entwickeln. |
Daher hielt Lewis diesen Zustand (T2) für
den Grundzustand, der durch andere Gene in den jeweils
benötigten Zustand (A1 bis A8) überführt
wird. Er meinte dann, dass für jedes weitere Segment ein Gen
zuständig sei. Dieses Modell sah zunächst
folgendermaßen aus (ist später verändert
worden): Für jedes Segment gibt es ein Gen. Dieses Gen wird in
dem entsprechenden Segment, für das es zuständig ist,
exprimiert und zusätzlich in allen dahinter liegenden
Segmenten. Weiter stromabwärts (in Richtung der Ablesung bei
der Transcription) liegende Gene werden weiter hinten exprimiert (sog.
Kolinearität der Gene mit der Expressionssequenz auf der DNA).
Dieses Modell ließ folgende Voraussagen zu:
1. Eine Mutation eines der Gene muss rezessiv sein. Denn ist ein Allel
des Gens mutiert, so wird das regulative Protein noch vom 2. Allel
gebildet und die Mutation dürfte sich phänotypisch
nicht auswirken.
2. Sind beide Kopien des Gens mutiert, so übernimmt das vor
ihm liegende Gen die Kontrolle. Es müsste also eine weiter
hinten liegende Struktur durch eine weiter vorn liegende ersetzt
werden, was auch der Fall ist (man denke an bithorax, was als Beispiel
genommen werden kann). Solche Mutationen werden loss-of-function
Mutationen genannt, weil die eigentliche Funktion verloren gegangen
ist.
3. Wird ein Gen, das eigentlich nur in einem hinteren Segment
exprimiert werden sollte, in einem vorderen Segment exprimiert, so
kommt es zu einer dominanten Mutation, weil ja jetzt weiter vorn das
regulative Protein gebildet wird, was ansonsten erst weiter hinten
exprimiert werden würde. Es handelt sich dann um eine
gain-of-function Mutation, weil jetzt das Gen eine Funktion
übernimmt, die sonst nicht ausgeführt würde.
Ein Beispiel dafür ist die Antennapediamutation (an Stelle der
Antenne wird ein Bein ausgebildet).
Die Voraussagen des Modells konnten alle bestätigt werden.
Das Antennapediagen und der ANT-C: Gehring interessierte sich besonders für die Antennapedia-Mutation bei Drosophila. Das ist eine Mutation bei der die Antenne am Kopf, durch ein Bein des zweiten Brustsegmentes ersetzt ist. Es treten allerdings verschiedene Varianten dieser Mutation auf. Die erste wurde von Elizaveta Balkaschina 1929 beschrieben. Sie hatte die von ihr entdeckte Variante der Mutation aristapedia genannt, weil ein federförmiger Anhang auf der Antenne, die arista, beinähnlich ausgebildet war (also kein vollständiges Bein). Die erste Mutation, bei der die Antenne durch ein vollständig ausgeprägtes Bein ersetzt war, wurde von Calvarez 1948 entdeckt. Diese Form der Mutation wurde später von Gehring Nasobemia getauft nach einem Gedicht von Christian Morgenstern, in dem Tiere beschrieben werden, die auf der Nase laufen. Gerolf Steiner hat darüber unter dem Pseudonym H. Stümpke eine fiktive wissenschaftliche Abhandlung über die sog. Rhinogradentia geschrieben. Das Gedicht von Morgenstern lautet:
Die Homeobox und
die Homeodomäne: In den 70er Jahren wurden die
Methoden der rekombinativen DNA Technologie entwickelt. Dazu
gehören vor allen die verschiedenen Restriktionsenzyme, mit
denen sich DNA in kleine Stücke schneiden lässt,
Plasmide und Viren, in die diese Stücke eingesetzt werden
können, sowie die Möglichkeit die Plasmide wieder in
Bakterien einzuführen und zu vermehren, wodurch das Gen, das
in dem Plasmid enthalten ist, geklont wird. So können
große Mengen eines einzelnen Gens gewonnen werden und damit
anschließend sequenziert werden.
Außerdem hatte man
das Enzym reverse Transcriptase entdeckt, das RNA in DNA umschreibt.
Mit seiner Hilfe ist es möglich mRNA in DNA umzuschreiben,
diese in ein Plasmid einzusetzen und zu klonieren. Ein solches
DNA-Stück wird cDNA genannt (von copy DNA, diese DNA
enthält also keine Introns, entspricht also nicht dem Gen im
Erbgut).
Um ein Gen zu isolieren brauchte man damals noch irgendwelche
Informationen über die Genprodukte, z.B. die Sequenz der mRNA
oder etwas Ähnliches. Für homeotische Gene
verfügte man aber nicht über solche Informationen, so
dass neue Methoden erforderlich waren, wenn man sie finden und
sequenzieren wollte. Nachdem die Klonierung von Genen möglich
war, hatte Gehring damit begonnen, eine Genbibliothek von Drosophila
anzulegen.
Eine solche Genbibliothek besteht aus tausenden
verschiedener Plasmide, die alle eine unterschiedliche kurze
DNA-Sequenz von Drosophila enthalten. Von Hogness wurde dann die
Methode des Chromosomen-walking entwickelt, um die Sequenz eines
bestimmten Gens zu finden. Diese Methode besteht darin, dass man von
einer bestimmten Stelle auf dem Chromosom, deren Sequenz man kennt, die
daneben liegende in einer Genbibliothek finden kann, indem man diese
Sequenz mit der Bibliothek hybridisiert und so nach Sequenzen sucht,
die eine Überlappung mit der Ausgangssequenz aufweisen und so
kann man fortfahren.
Ist man eine ganze Strecke "gewandert", kann man
durch in vivo Hybridisierung herausfinden, wo diese letzte Sequenz im
Chromosom lokalisiert ist. Mit dieser Methode war es Hogness gelungen,
das Ultrabithoraxgen aus dem Bithoraxkomplex zu isolieren und zu
klonen. Gehring hatte sich immer außerordentlich für
das Antennapediagen interessiert und nahm sich nun vor, dieses mit
derselben Methode zu isolieren. Die Einzelheiten dieses Unternehmens
sollen hier nicht geschildert werden, aber es war ein sehr aufwendiges
langwieriges Stück Arbeit, das fast 4 Jahre in Anspruch nahm.
Als das schließlich erreicht war, stellte ein Mitarbeiter von
Gehring eine cDNA vom Antennapediagen her und hybridisierte es in vivo
mit dem gesamten Erbgut von Drosophila. Dabei trat das
überraschende Ergebnis auf, dass diese DNA-Sequenz auch mit
DNA-Sequenzen außerhalb des Antennapediagens hybridisierte.
Ein Gen an das die Antennapedia-cDNA hybridisierte war das fushi tarazu
Gen (ftz), das kurz zuvor isoliert worden war. Dabei handelt es sich um
ein Gen, das dazu führt, dass zu wenig Segmente ausgebildet
werden, wenn beide Allele mutiert sind. Daher wurde nun dieses Gen
kloniert, um es mit dem Antennapediagen vergleichen zu können.
Es stellte sich dann heraus, dass beide Gene eine vergleichbare Sequenz
im letzten Exon besitzen. Um herauszufinden, ob diese Sequenz eine
bestimmte Bedeutung hat, wurde eine in vivo Hybridisierung des Erbgutes
mit dem letzten Exon vorgenommen. Dabei stellte sich heraus, dass die
Sequenz mit etwa 12 weiteren Genen hybridisierte.
Da das
Ultrabithoraxgen aus dem Bithoraxkomplex ja schon kloniert war, konnte
man prüfen, ob es auch so eine Sequenz enthielt. Und siehe da,
das war tatsächlich der Fall und ebenfalls im letzten Exon!
Damit war Gehring klar, dass sie hier etwas sehr Wichtiges entdeckt
hatten. Sie gaben daher der Sequenz den Namen Homeobox.
Aus der Sequenzierung ging dann hervor, dass die zugehörige
DNA-Sequenz aus 180 Nukleotiden besteht, der 60 Aminosäuren
entsprechen, die in den zugehörigen Proteinen die sog. Homeodomäne codieren.
Die Funktion dieser Domäne war allerdings zu diesem Zeitpunkt
noch völlig unbekannt.
Dass es zwischen verschiedenen
Proteinen Sequenzähnlichkeiten gibt, ist an sich noch nichts
Besonderes, aber dass diese hier in homeotischen Genen lagen, versprach
zu einer aufregenden Sache zu werden. Daher wurde eine Hybridisierung
dieser Sequenz mit dem Erbgut von Drosophila und auch anderen
Organismen vorgenommen. Schon kurz darauf fanden sich zwei weitere Gene
Deformed (Dfd) und abdominal-A (abdA), die beide durch homeotische
Mutationen bekannt waren. Gehring, der diese Befunde mit DeRobertis
diskutierte, beschloss zu untersuchen, ob es auch homologe Sequenzen
zur Homeobox bei anderen Tieren gibt. DeRobertis und McGinnies fanden
dann tatsächlich ein solches Gen bei Xenopus.
Dieser Befund
machte Schlagzeilen, weil nun die Möglichkeit bestand, dass es
bei Insekten und Wirbeltieren ähnliche Prinzipien der
genetischen Kontrolle der Entwicklung gibt. Daher stürzten
sich viele Untersucher auf dieses Thema und schon bald waren
Homeoboxgene in der Maus und sogar beim Menschen entdeckt und isoliert.
Nun wurde es natürlich Zeit herauszubekommen, welche Funktion
dieser Domäne zukommt. Dazu wurden Sequenzvergleiche mit allen
computergespeicherten Sequenzen vorgenommen. Shepherd fand dann eine
geringe aber signifikante Sequenzhomologie zum mating-Protein von Hefe.
Von diesem Protein war bekannt, dass es ein regulatorisches Gen ist und
dass es einen Repressor codiert. Das war der erste Hinweis darauf, dass
die homeotischen Gene Transcriptionsfaktoren codieren könnten.
Transcriptionsfaktoren sind Proteine, die eine Domäne besitzen
mit deren Hilfe sie sich an ganz bestimmte Stellen der DNA binden und
dort ganz bestimmte Gene aktivieren.
Lewis hatte gedacht, dass der BX-C-Komplex aus 8 Genen besteht, die
jeweils für eines der Abdominalsegmente verantwortlich sind.
Nun, da die entsprechenden gentechnologischen Möglichkeiten
zur Verfügung standen, konnte der Komplex genauer analysiert
werden. Dabei stellte sich heraus, dass es nur 3 Gene gibt,
nämlich Ubx (Ultrabithorax), abdA (abdominal A) und AbdB
(Abdominal B). Diese Gene haben aber sehr komplexe regulatorische
Regionen. Weiter stellte sich dann heraus, dass das Antennapediagen
ebenfalls in einem Genkomplex von 5 Genen liegt, der ANT-C genannt wird
(s. Abb. 4).
Wie oben schon angesprochen, wurde auch bei den Wirbeltieren nach
homologen Genen gesucht, speziell bei der Maus. Man wurde auch
fündig und stellte fest, dass es bei der Maus im Unterschied
zu Drosophila vier cluster (Komplexe) von Genen mit einer Homeobox
gibt. Diese Gene werden jetzt Hoxgene genannt (s. Abb. 4).
Während es nun bei Drosophila zwei getrennt liegende Komplexe,
den ANT-C und den BX-C gibt, liegen bei der Maus (und das gilt auch
für andere Wirbeltiere und auch für den Menschen) die
entsprechenden homeotischen Gene alle in einem Komplex (ein Komplex
kann bis zu 13 Genen enthalten). Die Gene in diesem Komplex haben aber
ganz ähnliche Eigenschaften wie bei Drosophila. Sie werden
zeitlich nacheinander und kolinear zur Körperachse exprimiert.
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Abb. 4 Vergleich der
Hox-Gen-Komplexe bei Drosophila und der Maus
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Man geht heute davon aus, dass es in der Evolution
einen Urcluster von Hoxgenen gegeben hat (Amphioxus hat nur einen
cluster) und dass im Laufe der Wirbeltierevolution zwei
Genomduplikationen (und damit auch Duplikationen des Urclusters)
stattgefunden haben. Der genaue Ursprung der Hoxgene ist noch nicht
bekannt.
Bei Drosophila werden die Hoxgene im embryonalen Ektoderm, im
Neuroektoderm und im Darmtrakt exprimiert. Dasselbe gilt auch
für die Maus und das Küken, wo die Gene im
Nervensystem, dem paraxialen Mesoderm und dem Darmsystem exprimiert
werden. In allen Fällen gilt die Kolinearität der
Expression.
Die überraschendste Beobachtung ist die enorme Konservierung
der Hoxgene im Verlaufe der Evolution. Sowohl die strukturelle
Organisation, das Expressionsmuster und die Funktionen der Hoxgene sind
weitgehend erhalten geblieben. Trotzdem wird nach und nach klar, dass
kleinere Abweichungen existieren und dass diese mit
Veränderungen der Morphologie korrelieren.
Quellen:
Lewis EB (1978) A gene complex controlling segmentation in Drosophila.
Nature 276: 565–570.
Gehring, W.J. Master Control Genes in Development and Evolution, Yale
University Press, 1998
Kontakt:: Kontakt: Mario.Hupfeld@uni-konstanz.de